白藜蘆醇對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠胰腺細(xì)胞凋亡的影響

【摘要】 目的:探討白藜蘆醇對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎(SAP)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)控基因Bax和Bcl_2表達(dá)的影響。方法:L_精氨酸鹽酸鹽分次間隔2h注入大鼠腹腔和皮下以建立SAP模型,48只大鼠隨機(jī)分為白藜蘆醇(RES)治療組、非治療(SAP)組(各20只)和正常對(duì)照(NS)組(8只)。RES組于皮下注射L_精氨酸鹽酸鹽后立即腹腔注射白藜蘆醇。各組在末次注射后分別于6、12、24和48h測血清淀粉酶、胰腺濕/干重比值,觀察各組胰腺組織的病理變化并評(píng)分,免疫組化SP法檢測胰腺組織Bax和Bcl_2基因表達(dá),同時(shí)行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)換酶介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記檢測胰腺細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:RES組12、24h血清淀粉酶活性明顯下降,24、48h胰腺濕/干重比值降低,胰腺組織出血壞死減輕,24、48h病理評(píng)分均低于SAP組(P<0.05)；給藥后6、12h細(xì)胞凋亡指數(shù)和Bax、Bcl_2基因表達(dá)均高于SAP組(P<0.01)。結(jié)論:白藜蘆醇可誘導(dǎo)SAP受損胰腺細(xì)胞凋亡,抑制血清淀粉酶釋放,減輕大鼠胰腺病理損傷,其機(jī)制可能是通過上調(diào)Bax和Bcl_2基因的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 重癥急性胰腺炎 白藜蘆醇 細(xì)胞凋亡 Bax基因 Bcl_2基因

　　Effect of Resveratrol on Apoptosis of Pancreatic Cells in Rats with Severe Acute Pancreatitis

　　LI Yong_sheng, WEN Jun, LIU Xing_mu, LIU Xiao_ping, SU Jian_dong

　　(Department of Hepatobiliary Surgery, The Second Affiliated Hospital, Shantou University Medical College， Shantou 515041, China;Department of Physiology, Shantou University Medical Colleg, Shantou 515041, China; Department of Gastroenterology, The Second Affiliated Hospital, Shantou University Medical College, Shantou 515041, China)

　?。跘bstract］ob[x]jective: To investigate the effects of resveratrol on apoptosis of pancreatic cells and apoptosis_regulated gene Bax and Bcl_2 in rats with severe acute pancreatitis(SAP). Methods: L_arginine was given to rats by intraperitoneal and subcutaneous injection twice at an interval of 2 hours to establish the model of SAP. Forty_eight rats were randomly divided into resveratrol_treated(RES, n=20)group, SAP model(SAP, n=20)group and control(NS, n=8)group. Resveratrol was given to the rats of RES group by intraperitoneal injection after the subcutaneous injection of L_arginine. Rats were sacrificed at 6, 12, 24 and 48 hours after the last injection to determine the levels of serum amylase and the wet/dry weight ratio of pancreas. Pancreatic histopathological score ba[x]sed on microscopic changes was evaluated. Apoptosis of pancreatic cells was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase_mediated dUTP_biotion nick end labeling method, and the ex[x]pression of Bax and Bcl_2 gene was detected by SP immunohistochemical technique. Results: After resveratrol being rejected, the serum amylase decreased significantly at 12 and 24 hours, the wet/dry ratio of pancreas reduced at 24 and 48 hours. The pathological changes of pancreas alleviated obviously. The apoptopic index of pancreatic cells increased significantly compared with the SAP group at 6 and 12 hours, corresponding with the ex[x]pression of the Bax and Bcl_2 gene. Conclusion: Resveratrol can significantly alleviate the pancreatic pathological damaged conditions of SAP in rats via the induction of apoptosis in injured pancreatic cells. Up_regulation of Bax and Bcl_2 gene ex[x]pression might be the mechanism of resveratrol in treating SAP in rats.

　　［Key Words］severe acute pancreatitis; resveratrol; apoptosis; Bax gene; Bcl_2 gene

　　重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)病情危重,并發(fā)癥多,病死率高。胰腺腺泡細(xì)胞損傷釋放胰酶和炎癥介質(zhì)是其病情危重的關(guān)鍵因素。近年來人們在急性胰腺炎(AP)發(fā)病機(jī)制方面的研究注意到細(xì)胞凋亡與AP病程及預(yù)后密切相關(guān),發(fā)現(xiàn)AP的嚴(yán)重程度與胰腺細(xì)胞的凋亡呈負(fù)相關(guān)。誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞凋亡可改善胰腺炎的病變發(fā)展,而抑制胰腺細(xì)胞凋亡可加重胰腺炎的病變發(fā)展。胰腺細(xì)胞凋亡可能是對(duì)胰腺損傷有利的反應(yīng)［1］。因此誘導(dǎo)損傷的胰腺細(xì)胞凋亡可能成為治療SAP的新策略。我們通過建立大鼠SAP模型,觀察白藜蘆醇對(duì)SAP胰腺細(xì)胞凋亡的影響,從而探討其治療SAP的機(jī)制。

　　1 材料與方法

　　1.1 儀器與試劑

　　CX9全自動(dòng)生化分析儀、電熱恒溫干燥箱、低溫高速離心機(jī)(貝克曼公司,美國)；1604型精密電子天平(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠,中國)；L_精氨酸鹽酸鹽(BBI公司,加拿大。分析純級(jí))。白藜蘆醇(上?？稻呕び邢薰?，中國。純度>98%)；Bax,Bcl_2免疫組化染色試劑盒(SP9000系列。其中抗體兔抗Bax、Bcl_2為美國Santa_Cruz公司產(chǎn)品)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(中國)；Tunel試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司,中國)。

　　1.2 動(dòng)物分組及模型制備

　　健康雄性SPF級(jí)Wistar大鼠(廣州南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)48只,體質(zhì)量170～210g，隨機(jī)分為白藜蘆醇(RES)治療組(n=20)、非治療(SAP)組(n=20)和正常對(duì)照(NS組)組(n=8)。實(shí)驗(yàn)前均禁食12h,自由飲水。參照文獻(xiàn)［2］建立SAP模型：先于腹腔內(nèi)注射L_精氨酸鹽酸鹽溶液(200g/L)450mg/100g,間隔2h后,再經(jīng)皮下注射150mg/100g。在SAP模型基礎(chǔ)上，立即給予20只大鼠白藜蘆醇溶液(按25mg/kg)腹腔注射，建立RES組。NS組以相同方式注射等體積無菌NS。

　　1.3 標(biāo)本制作

　　SAP組和RES組分別于注射后6、12、24、48h各取5只處死(NS組取2只),心臟取血2～4mL,離心分離血清,－70℃冰箱保存。同時(shí)取大鼠部分胰腺組織用中性福爾馬林固定,石蠟包埋,備用于組織病理學(xué)檢查、免疫組化和細(xì)胞凋亡的檢測,剩余胰腺組織進(jìn)行濕/干重比值的測定。

　　1.4 觀察指標(biāo)

　　用CX9全自動(dòng)生化分析儀測定血清淀粉酶；取部分胰腺組織稱濕重后,置于60℃電熱恒溫干燥箱中連續(xù)烘烤24h,去除水分至質(zhì)量恒定不變,稱干重,計(jì)算胰腺濕/干比值。石蠟切片,蘇木精_伊紅染色,光鏡下觀察胰腺組織病理學(xué)改變,同時(shí)按照鏡下病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［3］(表1)由病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲評(píng)分。Bax,Bcl_2基因表達(dá)(免疫組化SP法)：胰腺細(xì)胞胞漿染色呈棕褐色或棕黃色為陽性細(xì)胞。用BI_2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟有限公司，中國)進(jìn)行平均光密度分析，并用其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。胰腺細(xì)胞凋亡［用原位末端標(biāo)記(TUNEL)染色法］：胰腺組織常規(guī)石蠟切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,PBS沖洗2×3min；蛋白酶K(20μg/mL,10mmol/L Tris/HCl,pH=7.4～8.0)37℃消化15～30min,PBS沖洗2×3min；擦干組織周圍的水分,每片加25μL的Tunel反應(yīng)液,蓋片,于孵育盒中37℃,60min,PBS沖洗3×3min；擦干組織周圍水分,每片加25μL堿性磷酸酶抗體,于孵育盒中37℃,30min,PBS沖洗3×3min；擦干組織周圍水分,每片加1～2滴BCIP/NBT,室溫下孵育10～30min,PBS沖洗3×3min；核快紅對(duì)比染色；直接用水性封固劑封固,60℃烘干,光鏡下直接觀察,細(xì)胞核藍(lán)黑色為陽性細(xì)胞。凋亡指數(shù)(AI)計(jì)算：選取陽性細(xì)胞數(shù)量多的5個(gè)高倍視野(×400),分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù),AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×。

　　表1 胰腺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（略）

　　Table 1 Histopathologic scoring criteria of pancreas

　　1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　用SPSS11.5版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以

2 結(jié)果

　　2.1 血清淀粉酶活性測定結(jié)果

　　SAP組6h后血清淀粉酶活性升高,24h達(dá)高峰,之后下降；RES組12h(P<0.05)和24h(P<0.01)血清淀粉酶活性明顯下降(表2)。

　　表2 各組血清淀粉酶活性測定結(jié)果（略）

　　Table 2 The results of serum amylase among groups

　　與NS組比 1)P<0.05,2)P<0.01；與SAP組比 3)P<0.05,4)P<0.01

　　2.2 胰腺組織濕/干重比值結(jié)果

　　SAP組和RES組胰腺組織濕/干重比值與NS組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),RES組24、48h胰腺組織濕/干重比值明顯降低(P<0.05，表3)。

　　表3 各組胰腺組織濕/干重比值結(jié)果（略）

　　Table 3 Wet/dry ratio of pancreas among groups

　　與NS組比 1)P<0.01；與SAP組比 2)P<0.05

　　2.3 胰腺組織病理學(xué)改變及評(píng)分結(jié)果

　　NS組各時(shí)相胰腺組織正常,無病理改變。SAP組6h鏡下見胰腺小葉間充血、水腫,伴少量炎癥細(xì)胞浸潤,小葉結(jié)構(gòu)完整,伴局限點(diǎn)狀壞死,無出血；12h見小葉間明顯充血水腫、炎細(xì)胞浸潤增多,伴點(diǎn)狀壞死和出血,可見凋亡小體形成；24h見腺泡張力大、廣泛分隔小葉,小葉結(jié)構(gòu)破壞、喪失,實(shí)質(zhì)出血明顯,大量炎性細(xì)胞浸潤；48h見小葉間及小葉內(nèi)廣泛重度水腫,小葉結(jié)構(gòu)彌漫性破壞,喪失,出血嚴(yán)重,炎性細(xì)胞彌漫性浸潤。與SAP組比，RES組6、12h胰腺病理改變輕(P>0.05)；24、48h胰腺病理改變明顯減輕(P<0.05，表4，圖1，封4)。

　　表4 各組各時(shí)相胰腺組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果（略）

　　Table 4 Histopathological score of pancreas among groups

　　與NS組比 1)P<0.05,2)P<0.01；與SAP組比 3)P<0.05

　　2.4 Bax、Bcl_2基因蛋白表達(dá)結(jié)果

　　免疫組化SP法結(jié)果顯示,Bax基因表達(dá)于胰腺腺泡細(xì)胞胞漿中,而Bcl_2基因表達(dá)于胰腺導(dǎo)管細(xì)胞胞漿中。兩者在NS組中表達(dá)弱,SAP組和RES組表達(dá)明顯增強(qiáng),RES組6、12h均高于SAP組(P<0.01),24、48h無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SAP組和RES組各時(shí)相與NS組比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表5，圖2、3，封4)。

　　表5 各組各時(shí)相胰腺Bax和Bcl_2表達(dá)情況（略）

　　Table 5 The ex[x]pression of Bax gene and Bcl_2 gene in pancreas among groups

　　與NS組比 1)P<0.01；與SAP組比 2)P<0.01

　　2.5 TUNEL凋亡檢測結(jié)果

　　SAP組和RES組胰腺凋亡細(xì)胞明顯增多,兩組在48h無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而RES組在6、12、24h的AI均顯著高于相應(yīng)時(shí)相的SAP組(6、12h,P<0.01;24h,P<0.05，表6，圖4，封4)。

　　表6 各組胰腺組織AI檢測結(jié)果（略）

　　Table 6 AI of pancreatic cells among groups

　　與NS組比 1)P<0.01；與SAP組比 2)P<0.05,3)P<0.01

　　3 討論

　　細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞自主有序死亡,是消滅衰老和受損細(xì)胞的生命調(diào)控過程,細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死本質(zhì)區(qū)別在于凋亡不釋放細(xì)胞內(nèi)容物和炎癥介質(zhì),不引起炎癥反應(yīng),而壞死引起強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)。在AP中,凋亡和壞死同時(shí)并存，而胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡與胰腺炎的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān),Kaiser等［4］通過誘導(dǎo)輕重不同的AP模型闡述了這一點(diǎn),同時(shí)發(fā)現(xiàn)抑制腺泡細(xì)胞凋亡后,壞死細(xì)胞明顯增多,胰腺炎的嚴(yán)重程度明顯加重。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AP時(shí)誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡可減輕AP的嚴(yán)重程度［5,6］，提示細(xì)胞凋亡可能是AP時(shí)宿主自身的保護(hù)性反應(yīng)，誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞凋亡可能是治療AP的一種新途徑。

　　AP時(shí)腺泡細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的,調(diào)控途徑中的一條是Bcl_2家族控制的線粒體途徑。Bax、Bcl_2是Bcl_2家族中2個(gè)比較重要的成員,他們通過影響線粒體膜陰離子通道的通透性調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C的釋放來誘導(dǎo)和抑制細(xì)胞凋亡。胰腺腺泡細(xì)胞含Bax基因而不含Bcl_2基因,導(dǎo)管細(xì)胞則含Bcl_2基因。AP時(shí)Bax、Bcl_2基因過分表達(dá)引起胰腺腺泡細(xì)胞容易發(fā)生細(xì)胞凋亡,而導(dǎo)管細(xì)胞凋亡被抑制則表現(xiàn)增生，從而減輕胰腺炎癥損傷，修復(fù)已受損胰腺組織，導(dǎo)管增生可能與胰腺形成管狀復(fù)合體有關(guān)［1,7,8］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)建立大鼠SAP模型后,各時(shí)相的胰腺組織病變程度不同,胰腺細(xì)胞凋亡的程度也不同。SAP組和RES組各時(shí)相胰腺AI均明顯升高，6h為顯著，之后開始下降，RES組細(xì)胞AI在6、12h比SAP組顯著升高。凋亡基因表達(dá)結(jié)果顯示:Bax基因表達(dá)于胰腺腺泡細(xì)胞，Bcl_2基因則表達(dá)于胰腺導(dǎo)管細(xì)胞，其表達(dá)部位與Reid等［9］的研究相一致；兩者在SAP組和RES組各時(shí)相均明顯增強(qiáng)。RES組和SAP組的胰腺細(xì)胞Bax基因與Bcl_2基因的表達(dá)均于6h開始升高，12h達(dá)高峰,24h開始下降,在6、12h　RES組較SAP組顯著增強(qiáng)，其變化趨勢與胰腺細(xì)胞AI的變化大體一致，提示胰腺細(xì)胞凋亡可能是通過誘導(dǎo)Bax和Bcl_2基因的表達(dá)上調(diào)來實(shí)現(xiàn)的。

　　白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗炎、抗心血管疾病、植物激素樣活性等多種藥理活性,其中一個(gè)重要機(jī)制是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而起作用。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能通過上調(diào)Bax基因和下調(diào)Bcl_2基因的表達(dá)而誘導(dǎo)人類食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡［10］。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)RES組12、24h血清淀粉酶活性下降,24、48h鏡下胰腺組織炎癥、出血、壞死明顯減輕,胰腺濕/干重比值明顯減小,凋亡檢測顯示RES組6、12h胰腺細(xì)胞AI明顯高于SAP組,并且Bax和Bcl_2基因蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)增高,說明白藜蘆醇能早期誘導(dǎo)AP胰腺細(xì)胞凋亡,從而減輕胰腺組織炎癥,減輕AP的嚴(yán)重程度,其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)Bax和Bcl_2基因蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。但AP的發(fā)病機(jī)制是多途徑的,且RES組血清淀粉酶活性于12、24h下降明顯這一變化趨勢與胰腺細(xì)胞凋亡于6、12h表達(dá)明顯這一變化不太一致，因此，白藜蘆醇對(duì)SAP的治療作用是否存在其它機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。



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