五田保肝液對(duì)酒精性肝病大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制

　    作者：蘇金玲 畢業(yè)東1 姜希娟 宋星星 范英昌　 作者單位：1 天津市漢沽區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 (天津中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，天津 300193)

　　【摘要】 目的 探討五田保肝液對(duì)酒精性肝病大鼠肝細(xì)胞凋亡和肝組織腫瘤壞死因子(TNF)α、Caspase3 mRNA表達(dá)的影響。方法 將100只Wistar大鼠隨機(jī)分成6組：對(duì)照組10只、模型組、五田保肝液低、中、高劑量組、易善復(fù)組各18只，采用白酒輔以吡唑、玉米油的混合食料灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型，12 w末處死大鼠， TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況，實(shí)時(shí)定量RTPCR法檢測(cè)TNFα、Caspase3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 五田保肝液可降低酒精性肝病大鼠肝細(xì)胞的凋亡指數(shù)(AI)和肝組織TNFα、Caspase3 mRNA的表達(dá)，且以中、高劑量效果更加顯著; TNFα、Caspase3 mRNA的表達(dá)與AI呈正相關(guān)(r=0.803,r=0.795,P<0.01)。 結(jié)論 五田保肝液尤其是中、高劑量對(duì)大鼠酒精性肝病肝細(xì)胞凋亡具有抑制作用，其機(jī)制可能與降低TNFα、Caspase3 mRNA的表達(dá)有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】 五田保肝液;酒精性肝病;腫瘤壞死因子α;Caspase3

　　長(zhǎng)期大量酒精攝入可導(dǎo)致酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的發(fā)生。然而ALD的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，近年來(lái)研究認(rèn)為酒精誘發(fā)的肝細(xì)胞凋亡在ALD的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用。本文經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間臨床驗(yàn)證，有確切防治ALD療效的專(zhuān)利制劑“五田保肝液”(專(zhuān)利號(hào)：CN02158170.3)作為研究對(duì)象，探討其對(duì)ALD大鼠肝細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用及分子機(jī)制，為防治ALD提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和理論依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　Wistar雄性大鼠100只，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供〔許可證號(hào)：SCXK9(京)20050013〕，體重200 g左右。

　　1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

　　五田保肝液由深圳市三九現(xiàn)代中藥有限公司提供;易善復(fù)(多烯磷脂酰膽堿膠囊)：賽諾菲安萬(wàn)特(北京)制藥有限公司生產(chǎn);批號(hào)/BN：D8099;規(guī)格228 mg/片;62度牛欄山二鍋頭：由北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn);吡唑：購(gòu)自上海晶純?cè)噭┯邢薰?玉米油：購(gòu)于中糧食品營(yíng)銷(xiāo)有限公司;In Situ Cell Death Detection Kit試劑盒購(gòu)于美國(guó)Roche公司;RNA提取試劑盒RNASolv Reagent購(gòu)自O(shè)mega公司;SYBR Primesc[x]ript TM RTPCR Kit試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組和模型制備

　　大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，分為對(duì)照組(N組)10只、模型組(M組)、五田保肝液低劑量組(WⅠ組)、中劑量組(WⅡ組)、高劑量組(WⅢ組)、易善復(fù)組(Y組)各18只。M組、WⅠ組、WⅡ組、WⅢ組、Y組大鼠均以62度牛欄山二鍋頭酒(10 ml·kg-1·d-1)、玉米油(2 ml·kg-1·d-1)、吡唑(25 mg·kg-1·d-1)混合物灌胃,2次/d,早晚各1次。WⅠ組、WⅡ組、WⅢ組大鼠于兩次灌胃之間分別給予0.51、1.02 g·kg-1·d-1(成人等劑量)、2.04 g·kg-1·d-1的五田保肝液灌胃; Y組和M組大鼠于早晚兩次灌胃之間分別給予相當(dāng)于成人等劑量的易善復(fù)(0.12 g·kg-1·d-1)和相應(yīng)劑量的生理鹽水灌胃，N組則3次/d以生理鹽水灌胃。各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間均予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。造模時(shí)間為12 w。

　　1.3.2 取材

　　于第12周末，所有大鼠禁食12 h，頸椎脫臼處死大鼠后迅速剖腹取出肝臟，冰生理鹽水沖洗，然后取肝右葉部分組織置于凍存管后迅速投入液氮中冷凍保存，以備檢測(cè)分子生物學(xué)指標(biāo)之用;取肝左葉組織投入10%中性甲醛溶液固定組織，切片，以備檢測(cè)肝組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)。

　　1.3.3 TUNEL法檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞凋亡情況

　　陽(yáng)性定位在細(xì)胞核,凋亡細(xì)胞核呈棕黃色。觀察不少于5個(gè)高倍視野(400倍)，記數(shù)至少500個(gè)細(xì)胞。以凋亡指數(shù)反映凋亡程度。計(jì)算公式:凋亡指數(shù)(AI)=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×。

　　1.3.4 實(shí)時(shí)定量RTPCR檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNFα)、Caspase3 mRNA的表達(dá)

　　引物的設(shè)計(jì)與合成：TNFα引物序列：正義鏈：5′AAGTTCCCAAATGGGCTCCCT3′;反義鏈：5′CTGCTCCTCTGCTTGGTGGTTT3′;Caspase3引物序列：正義鏈5′CAGACAGTGGAACTGACGAT3′;反義鏈：5′TTTCAGCATGGCGCAAAGTG3′;以GAPDH為內(nèi)參，其引物序列為：正義鏈：5′CCCCCAATGTATCCGTTGTG3′;反義鏈：5′TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT3′?？俁NA的提取和檢測(cè)：按RNASolv Reagent的操作說(shuō)明書(shū)提取大鼠肝組織總RNA，紫外分析及瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA的純度、濃度及完整性。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,使用7300 system SDS software軟件分析PCR過(guò)程中樣本的CT值，每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均CT值，每一次反應(yīng)均設(shè)定陰性對(duì)照。采用2△△CT計(jì)算各目的基因相對(duì)反應(yīng)起始拷貝數(shù)。

　　1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，各組數(shù)據(jù)比較采用oneway ANOVA方法檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Person法。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 各組大鼠一般情況觀察

　　正常組大鼠健康狀況良好，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)1只死亡。模型組大鼠精神萎靡，毛發(fā)干枯蓬亂，部分大鼠出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，食量減少，大便稀，小便黃，至造模結(jié)束，體重增長(zhǎng)不明顯，至12 w末，因酒精誤入氣管死亡3只，因酒精急慢性中毒死亡7只。各給藥組大鼠情況好于模型組，精神較活躍，體重增加較之模型組快。其中WⅠ、WⅡ、WⅢ組和Y組因酒精誤入氣管分別死亡4、5、5、5只，因急慢性酒精中毒分別死亡4、4、3、4只。

　　2.2 TUNEL法觀察肝細(xì)胞凋亡情況

　　模型組大鼠肝細(xì)胞細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，其余各組的AI與對(duì)照組相比也有所升高(P<0.01)，但是WⅡ、Ⅲ組和Y組與M組相比AI下降明顯(P<0.01)，而WI組和M組相比AI無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

　　2.3 對(duì)ALD大鼠肝組織TNFα、Caspase3 mRNA表達(dá)的影響

　　M組TNFα、Caspase3 mRNA的表達(dá)明顯高于N組(P<0.01)，而五田保肝液各劑量組和Y組TNFα、Caspase3 mRNA的表達(dá)明顯低于M組(P<0.01)，MI組TNFα、Caspase3 mRNA的表達(dá)和Y組Caspase3 mRNA與N組相比，有所升高，差別具有顯著性(P<0.05)。見(jiàn)表1。表1 五田保肝液對(duì)ALD大鼠肝細(xì)胞AI、肝組織TNFα、Caspase3 mRNA表達(dá)的影響

　　2.4 ALD大鼠肝組織TNFα、Caspase3 mRNA表達(dá)與肝細(xì)胞AI的相關(guān)性分析

　　TNFα、 Caspase3 mRNA的表達(dá)與AI呈正相關(guān)(r=0.803，r=0.795，P<0.01)。

　　3 討 論

　　細(xì)胞凋亡是一種不同于壞死的細(xì)胞死亡方式，是細(xì)胞在基因的指導(dǎo)下“主動(dòng)自殺”的過(guò)程。凋亡是ALD過(guò)程中肝細(xì)胞死亡的重要方式〔1～3〕。肝細(xì)胞凋亡的程度與ALD病情有明顯的相關(guān)性〔4〕,所以試圖闡明ALD肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制，可能為ALD的防治提供新的思路和靶點(diǎn)〔5〕。

　　酒精及其代謝產(chǎn)物可激活肝的Kupffer細(xì)胞，竇內(nèi)皮細(xì)胞等，從而分泌大量TNFα，研究表明，低水平的TNFα參與肝細(xì)胞正常的生長(zhǎng)分化過(guò)程，但是高水平的TNFα的表達(dá)卻可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡〔6〕。Caspase家族是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中居中心地位，研究認(rèn)為Caspase3是引發(fā)細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的“核心”蛋白酶〔7〕，被稱(chēng)為死亡蛋白酶。

　　目前研究認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)的死亡信號(hào)可通過(guò)細(xì)胞外途徑(細(xì)胞表面死亡受體途徑)和細(xì)胞內(nèi)途徑(線粒體引發(fā)途徑)兩條主要的通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞外途徑中，死亡信號(hào)發(fā)揮作用依賴(lài)于死亡受體和死亡配體的結(jié)合〔8〕。TNFα與其受體(TNFRⅠ)結(jié)合后，聚集形成胞內(nèi)死亡復(fù)合體，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，終激活Caspase3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生〔9〕。已經(jīng)探明TNFα、Caspase3凋亡這一信號(hào)途徑是重要的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠肝細(xì)胞AI顯著高于對(duì)照，和TNFα、Caspase3 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)酒精及其代謝產(chǎn)物的刺激使TNFα高表達(dá)，進(jìn)而激活Caspase3是誘發(fā)ALD肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

　　對(duì)于ALD的治療，目前臨床方法并不多且效果不肯定。而中醫(yī)藥具有辨證施治的特點(diǎn)和整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì),對(duì)ALD的治療具有廣闊的應(yīng)用前景。中醫(yī)認(rèn)為飲酒能夠助濕生熱，長(zhǎng)期過(guò)量飲酒則濕熱酒毒內(nèi)蘊(yùn)，這是ALD的病機(jī)所在。專(zhuān)利制劑五田保肝液由田基黃、垂盆草、敗醬草、丹參、五味子、山楂、草決明、澤瀉、柴胡、生甘草組成。方中田基黃清熱利濕，解毒、散瘀、消腫、止痛，垂盆草清熱解毒、利尿消腫共為君藥，以解濕熱酒毒。敗醬草清熱解毒，排膿破瘀、丹參活血祛瘀共為臣藥，助君藥清熱利濕。酸入肝，五味子、山楂味酸能收斂肝陰，山楂亦能活血化瘀，草決明清肝熱、利水，澤瀉利水滲濕、泄熱，共為佐藥。柴胡主入肝經(jīng)，引諸藥入肝經(jīng)，為引經(jīng)藥。金匱曰：見(jiàn)肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾。甘草味甘補(bǔ)脾、又能解毒，調(diào)和諸藥，與柴胡共為使藥。該組方君臣佐使完備，無(wú)。根據(jù)ALD多因熱、濕、毒、虛而致，設(shè)立了以“清肝利濕，活血化瘀，分化解毒”為治療大法。經(jīng)過(guò)多年的臨床實(shí)踐，證實(shí)對(duì)ALD具有明確療效。

　　本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ALD治療各組和易善復(fù)雖然AI也高于對(duì)照，但是中藥中、高劑量和易善復(fù)的AI卻較模型顯著降低。說(shuō)明在ALD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，五田保肝液可通過(guò)抑制肝細(xì)胞的凋亡，起到保肝護(hù)肝的作用，而這種作用，具有劑量依賴(lài)性，以中、高劑量效果更加明顯。

　　五田保肝液各組和易善復(fù)組隨著TNFα、Caspase3表達(dá)的下降，AI也隨之降低，說(shuō)明五田保肝液發(fā)揮抗肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能和抑制TNFα、Caspase3的高表達(dá)有一定關(guān)系。另外，易善復(fù)組Caspase3 mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組，說(shuō)明在某種程度上，五田保肝液中、高劑量抑制ALD大鼠肝細(xì)胞凋亡的能力要強(qiáng)于易善復(fù)。但是五田保肝液低劑量組雖然TNFα、Caspase3的表達(dá)比模型組低， AI卻和模型組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明ALD過(guò)程中，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制是十分復(fù)雜的，是受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶類(lèi)和信號(hào)傳導(dǎo)途徑等調(diào)控的“瀑布”式激活過(guò)程。除了TNFα、Caspase3凋亡這條信號(hào)通路發(fā)揮了重要作用，還有更為復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的相互作用參與其中。