降鈣素原抗原的表達(dá)及其抗體的制備與初步鑒定

作者：劉琦    作者單位：蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 北京 102206
【摘要】  目的: 構(gòu)建降鈣素原（PCT）原核表達(dá)載體, 制備其多克隆抗體（pAb）和單克隆抗體(mAb), 并進(jìn)行特性鑒定。方法: 以甲狀腺癌細(xì)胞cDNA文庫為模板, 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T1PCT和PET32aPCT, 在大腸桿菌中分別表達(dá)GSTPCT和HisPCT融合蛋白, 用HisPCT免疫家兔和BALB/c小鼠制備兔pAb和鼠mAb。通過ELISA法測(cè)定抗人PCT抗血清效價(jià); 用Western blot、 間接免疫熒光鑒定pAb的特異性。使用間接ELISA法篩選分泌特異性抗PCT的雜交瘤細(xì)胞株, 采用Western blot和間接免疫熒光鑒定mAb的特異性。 結(jié)果: 構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T1PCT和PET32aPCT, 并在大腸桿菌中表達(dá)、 純化。經(jīng)ELISA法測(cè)得抗人PCT抗血清效價(jià)是1∶256 000。制備的抗PCT兔多克隆抗體可特異地識(shí)別重組和天然的PCT蛋白。獲得8株可穩(wěn)定分泌抗PCT的雜交瘤細(xì)胞株, 可識(shí)別重組人PCT蛋白, 其中有4株可特異性結(jié)合TT細(xì)胞質(zhì)中的天然蛋白。 結(jié)論: 成功地制備出兔抗人PCT抗血清和8株抗PCT的mAb, 為進(jìn)一步研究PCT在嚴(yán)重的細(xì)菌感染和膿毒癥中的病理及生理作用奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】  降鈣素原 原核表達(dá) 抗體制備 鑒定

　　降鈣素原（procalcitonin, PCT）來自定位于第11號(hào)染色體上（11P15, 4）的單拷貝基因, 該基因由2800個(gè)堿基對(duì)組成, 含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子, 基因全長(zhǎng)Mr約7 600。轉(zhuǎn)錄后在甲狀腺濾泡旁細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)翻譯成降鈣素原前體proprocalcitonin, 包括N端84個(gè)氨基酸、 活性降鈣素（CT, 32肽）和降鈣蛋白（katacalcin, 21肽）三部分, 分別由2肽（LysArg）及4肽（GlyLysLysArg）連接。降鈣素原前體在內(nèi)源多肽酶作用下剪掉nProCT端單一序列, 生成116個(gè)氨基酸的PCT。PCT是無激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)［1］。在正常情況下, 具有激素活性的降鈣素是在甲狀腺濾泡旁細(xì)胞產(chǎn)生與分泌, 并由細(xì)胞內(nèi)特殊蛋白酶分解PCT成降鈣素。正常人血中PCT濃度非常低, 然而在嚴(yán)重的細(xì)菌感染和膿毒癥時(shí), 在外周血液中發(fā)現(xiàn)完整的PCT濃度升高。我們構(gòu)建了重組表達(dá)載體, 獲得融合表達(dá)蛋白后, 免疫家兔和BALB/c小鼠, 制備抗PCT抗血清和抗PCT的單克隆抗體（mAb）, 并進(jìn)行特性鑒定, 為進(jìn)一步研究PCT的功能及其應(yīng)用提供有力的工具。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  TT細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心; 大腸桿菌BL21感受態(tài)菌株為本實(shí)驗(yàn)室自制。原核表達(dá)載體pGEX4T1和PET32a購自Amersham公司。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、 ExTaq酶、 T4連接酶等購自TaKaRa公司。PCR回收試劑盒、 質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司。BALB/c小鼠和大耳白兔子（2～2.5 kg, 雄性）購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心。小鼠骨髓瘤細(xì)胞株Sp2/0為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所免疫室制備。鼠抗His標(biāo)簽mAb、 HRP羊抗鼠IgG、 HRP羊抗兔IgG、 FITC羊抗鼠IgG、 ECL顯色系統(tǒng)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  PCT抗原的制備和純化  根據(jù)Human Protein Reference Databa[x]se中提供的PCT的氨基酸序列, 并結(jié)合應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAstar的表位分析, 以GenBank發(fā)表的核酸序列為準(zhǔn), 綜合設(shè)計(jì)引物。在其上游引物設(shè)計(jì)EcoRⅠ酶切位點(diǎn), 下游引物設(shè)計(jì)XhoⅠ酶切位點(diǎn), 片段長(zhǎng)度270個(gè)堿基（PCT的27～116位氨基酸）, 從TT細(xì)胞提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 以cDNA為模板擴(kuò)增目的片段?；厥盏哪康钠巍?pGEX4T1和PET32a載體經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后, 分別進(jìn)行連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌, 陽性克隆經(jīng)測(cè)序正確后抽提質(zhì)粒, 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。PCT在BL21細(xì)菌中以可溶性形式表達(dá), 表達(dá)后用親和層析法進(jìn)行了純化。

　　1.2.2  HisPCT融合蛋白的Western blot分析  將重組蛋白經(jīng)常規(guī)SDSPAGE凝膠電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 封閉液封閉后, 加入鼠抗His mAb與膜上的蛋白進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)后, 用HRP羊抗鼠IgG進(jìn)行檢測(cè), ECL顯色, 至目的條帶染色清晰時(shí)終止反應(yīng)。

　　1.2.3  兔抗人PCT抗血清的制備  將純化的PCT融合蛋白和等體積弗氏完全佐劑充分混合后, 每只家兔皮下多點(diǎn)注射融合蛋白800 μg; 初次免疫4周后加強(qiáng)免疫1次, 接下來1周后耳緣靜脈采血檢測(cè)抗體效價(jià)。2周后頸動(dòng)脈采血, 分離血清, 分裝后置-20℃保存。

　　1.2.4  兔抗PCT血清的特性鑒定  （1）ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià): ELISA檢測(cè)板用GSTPCT融合蛋白以0.1 mg/L的濃度包被。按梯度稀釋抗血清, 每孔加入100 μL（陰性對(duì)照為正常兔血清, 空白對(duì)照為二抗稀釋液）, 37℃孵育30 min洗滌3次后, 加入1∶10 000稀釋的HRP羊抗兔IgG, 37℃孵育30 min洗滌3次后進(jìn)行TMB顯色。（2）Western blot檢測(cè)PCT融合蛋白: 重組蛋白經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳后, 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 封閉液封閉后, 加入兔抗人PCT血清與膜上的蛋白進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)后, 用HRP羊抗兔IgG進(jìn)行檢測(cè), ECL顯色, 至目的條帶染色清晰時(shí)終止反應(yīng)。（3）間接免疫熒光檢測(cè): 當(dāng)TT細(xì)胞長(zhǎng)到1×106/瓶時(shí)鋪6孔板, 培養(yǎng)72 h后, 40 g/L多聚甲醛（10 g/L Triton）固定10 min; 空氣干燥5 min; PBS清洗標(biāo)本3次, 各2 min; 羊血清（用1×PBS按1∶10稀釋）在37℃封閉30 min; 滴加兔抗人PCT抗血清, 4℃過夜; PBS清洗標(biāo)本3次, 吹干; 滴加1∶200稀釋的FITC羊抗兔IgG, 室溫孵育30 min; PBS洗3次; 加染核試劑Hochest（用1×PBS按1∶5 000稀釋）, 室溫孵育30 min, PBS洗3次; 800 mL/L甘油封片, 鏡檢拍照。

　　1.2.5  鼠mAb的制備  3只6～8周齡, 體質(zhì)量為17～21 g的BALB/c小鼠。免疫時(shí), 每只小鼠分別經(jīng)皮下多點(diǎn)注射接種HisPCT 80 μg, 加等體積弗氏完全佐劑。首免4周后進(jìn)行第2次免疫, 每只小鼠分別經(jīng)皮下多點(diǎn)注射接種HisPCT 40 μg, 加等體積弗氏不完全佐劑。第2次免疫后7 d, 經(jīng)尾靜脈采血, 用ELISA法測(cè)定血清抗體的效價(jià)。選擇抗體效價(jià)高的小鼠, 于融合前4 d, 在尾靜脈注射HisPCT 40  μg/只, 加強(qiáng)免疫1次。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞株Sp2/0細(xì)胞按常規(guī)方法融合。用間接ELISA法篩選, 有限稀釋法克隆化, 并按常規(guī)方法制備mAb腹水。

　　1.2.6  抗PCT mAb的特性鑒定  （1）mAb的腹水效價(jià)及Ig亞類的測(cè)定: 腹水中mAb的效價(jià)采用間接ELISA法測(cè)定。采用Hbt小鼠mAb分型試劑盒測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗PCT mAb的Ig亞類。（2）mAb的特異性鑒定: Western blot檢測(cè), 將純化后GSTPCT和HisPCT加入還原性SDSPAGE上樣緩沖液中, 于100℃變性10 min。取重組蛋白進(jìn)行SDSPAGE, 并轉(zhuǎn)至PVDF膜, 封閉, 依次滴加雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清及HRP羊抗鼠IgG, ECL顯色后觀察結(jié)果。間接免疫熒光檢測(cè), 用雜交瘤細(xì)胞上清為一抗檢測(cè)PCT在TT細(xì)胞中的表達(dá), 具體實(shí)驗(yàn)方法同1.2.4。

　　2  結(jié)果

　　2.1  HisPCT融合蛋白的表達(dá)與鑒定  SDSPAGE電泳檢測(cè), 觀察到含重組質(zhì)粒pGEX4T1PCT和PET32aPCT的菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后, 在相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）約36 000和29 000處均出現(xiàn)1條蛋白帶, 其大小與預(yù)測(cè)的PCT融合蛋白的Mr相一致, 融合蛋白主要以可溶性形式表達(dá), 經(jīng)純化后蛋白純度可達(dá)到90%（圖1）。通過Western blot檢測(cè), 應(yīng)用抗His的抗體能夠在相應(yīng)位置檢測(cè)到His和HisPCT融合蛋白（圖2）。

　　圖1  PCT融合蛋白的SDSPAGE分析（略）

　　Fig 1  SDSPAGE analysis of PCT fusion protein

　　M: Protein marker; 1: Purified GSTPCT fusion protein; 2: Purified HisPCT fusion protein.

　　2.2  兔抗PCT抗血清的特性鑒定  （1）ELISA檢測(cè)板用GSTPCT融合蛋白以1 mg/L的濃度包被。間接法檢測(cè)抗體的效價(jià)為1∶256 000。用兔抗PCT抗血清對(duì)融合蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn), 證實(shí)在Mr約29 000和36 000處各有一特異性的條帶, 說明表達(dá)的PCT蛋白具有較好的免疫學(xué)活性。陽性對(duì)照（pET32a代替抗原）在相應(yīng)位置出現(xiàn)Mr為19 000的陽性條帶, 陰性對(duì)照（兔免疫前血清代替一抗）在相應(yīng)位置無條帶（圖2）。（2）間接免疫熒光檢測(cè): 將TT細(xì)胞鋪6孔板, 培養(yǎng)72 h后, 滴加兔抗PCT抗血清, 4℃過夜后, 加FITC羊抗兔IgG, 在熒光顯微鏡下觀察, 兔抗PCT抗血清與TT細(xì)胞質(zhì)中的天然PCT有陽性反應(yīng), 呈現(xiàn)明顯的綠色熒光。

　　圖2  兔抗PCT抗血清特異性的Western blot鑒定（略）

　　Fig 2  Characterization of specificity of rabbit  antiserum against PCT by Western blot

　　M: pET32a vector from E.coli BL21;  1: HisPCT fusion protein expressed in E.coli BL21;  2: GSTPCT fusion protein expressed in E.coli BL21;  3: Lysate of E.coli BL21.

　　2.3  雜交瘤的細(xì)胞株的建立及Ig亞類的測(cè)定  （1）經(jīng)細(xì)胞融合, 篩選及克隆化, 獲得8株能穩(wěn)定分泌抗PCT mAb的雜交瘤細(xì)胞株（GDE034、 GFH093、 GCE115、 GAG102、 GAB113、 GAF01、 GBA058、 GGH108）。（2）Ig亞類的測(cè)定結(jié)果顯示, mAb均為IgG1亞類。

　　2.4  mAb的特異性鑒定  （1）Western blot顯示, 雜交瘤GDE034、 GFH093、 GCE115、 GAG102、 GAB113、 GAF01、 GBA058、 GGH108的培養(yǎng)上清能同時(shí)檢測(cè)到GSTPCT和HisPCT（圖3）, 表明這8株mAb可特異的識(shí)別PCT。（2）間接免疫熒光檢測(cè): 將TT細(xì)胞鋪6孔板, 培養(yǎng)72 h后, 依次滴加雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清, 4℃過夜后, 加FITC羊抗鼠IgG, 在熒光顯微鏡下觀察, 其中4株雜交瘤GDE034、 GFH093、 GCE115、 GGH108的培養(yǎng)上清與TT細(xì)胞質(zhì)中的天然PCT有陽性反應(yīng)。

　　圖3  抗PCT mAb GGH108特異性的Western blot鑒定（略）

　　Fig 3  Characterization of antiPCT mAb specificity by Western blot

　　M: Lysate of  E.coli BL21; 1: HisPCT fusion protein expressed in  E.coli BL21; 2: GSTPCT fusion protein expressed in E.coli BL21.

　　3  討論
   
　　已證實(shí)PCT是一項(xiàng)有用的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)［2］, 同其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)CRP、 TNFα、 IL6、 IL8和IL10相比, PCT對(duì)嚴(yán)重的細(xì)菌感染和膿毒癥的早期診斷具有高的靈敏性和特異性［3］, 更有利于跟蹤這些情況的臨床過程。誘發(fā)PCT產(chǎn)生的主要原因是機(jī)體對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng), 病毒性疾病、 自身免疫病、 腫瘤、 體內(nèi)器官的細(xì)菌感染并不誘發(fā)PCT產(chǎn)生, 因此PCT可用于鑒別診斷細(xì)菌性和非細(xì)菌性疾病, 進(jìn)而用于臨床鑒別診斷。在膿毒癥患者PCT濃度通常是在10～100 μg/L之間或更高。當(dāng)治療后, PCT濃度將以其半衰期為20～24 h的速度降低至正常范圍(<0.5 μg/L）。因此, 對(duì)PCT濃度的檢測(cè)可對(duì)臨床威脅生命的感染過程做出監(jiān)測(cè), 同時(shí)有助于醫(yī)生制定有效的治療方案, 并終控制細(xì)菌感染。對(duì)于混合重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)［4］, PCT是能夠作為一個(gè)選擇性指標(biāo)鑒別診斷是否患有膿毒癥, 將其與系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合癥（SIRS）區(qū)分開［5］, 并被證實(shí)為好的輔助指標(biāo)。事實(shí)上, PCT不僅是一實(shí)驗(yàn)指標(biāo), 更重要是能夠監(jiān)測(cè)膿毒癥臨床過程。臨床試驗(yàn)研究證實(shí), 通過PCT對(duì)膿毒癥患者診斷和治療過程的監(jiān)測(cè), 為搶救患者提供了寶貴的時(shí)間, 可以減少不必要抗生素的使用, 縮短住院天數(shù), 從而降低患者總體治療費(fèi)用, 降低了資源浪費(fèi)的同時(shí)可快速明確病原學(xué)診斷, 提高治療效果。

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