樹突狀細(xì)胞雜交瘤苗誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞對PC3生長的抑制作用

　　探索以手術(shù)為主的綜合治療研究在改善胰腺癌患者生存率及生活質(zhì)量中十分重要.胰腺癌綜合治療有放療、化療、中醫(yī)藥治療及生物學(xué)治療.樹突狀細(xì)胞(DC)在誘導(dǎo)高效而特異的抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用L3}.本研究旨在觀察DC瘤苗誘導(dǎo)群體免疫效應(yīng)細(xì)胞對胰腺癌PC3的生長抑制作用.
　　材料和方法 　　
　　1.材料:胰腺癌細(xì)胞株P(guān)C3由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)院提供,外周血DC及群體免疫效應(yīng)細(xì)胞(去DC的單核細(xì)胞)來源于自愿正常人及北京市紅十字會血液中心.裸鼠BALB/C,體質(zhì)量16}18g,鼠齡5一7周,雌雄各半,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供.淋巴細(xì)胞分離液(Pharmacies,人粒/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、人白細(xì)胞介素(IL)}、人腫瘤壞死因子(TNF)一.IL-2,細(xì)胞毒性分析試劑盒(Promeges公司),胎牛血清(Hyclone公司),高糖DMEM培養(yǎng)基,1640培養(yǎng)基(Cibco公司),流式細(xì)胞標(biāo)記抗體CD1lcMicroBeads(MiltenyiBiotecGmbH).
　　2.DC與免疫效應(yīng)細(xì)胞分離、培養(yǎng):用PBS液稀釋新鮮全血并緩慢加人到有淋巴細(xì)胞分離液分離出單個核細(xì)胞(PBMC),以貼壁法獲取樹突狀細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞.以GM-CSF,IL-4,TNF-a,IL;-2擴(kuò)增DC及免疫效應(yīng)細(xì)胞、3.PC3培養(yǎng):取PC3細(xì)胞復(fù)蘇,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng).
　　4.細(xì)胞融合和篩選:用500g/L的聚乙二醇(PEG)按2:1的比例使DC與PC3細(xì)胞融合,融合前以30Gy照放射胰腺癌細(xì)胞PC3.再用CDllcMicroBeads標(biāo)記,MiniMACS磁式細(xì)胞分選器分選出PC3-DC.置于含重組小鼠GM-CSF(rmGM-CSF)和重組小鼠ILK(rmIL}.,500n彭L)以及20%胎牛血清的RPM11640完全培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)2一3周.
　　5.融合細(xì)胞成瘤試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)分為3組,每組裸鼠為6只:PC3-DC組、PC3+DC組、PC3組.分別在裸鼠右腋皮下接種O.1m11x10}.一2x10'0/L的活PC3-DC,PC3十DC,PC3.每3d觀察腫瘤的生長情況,共觀察45d.
　　6.體外實(shí)驗(yàn):取對數(shù)生長期的PC3做為靶細(xì)胞(2x104個/孔),效應(yīng)細(xì)胞分為3組,無DC刺激的}I組、有DC刺激的A2組、有DC瘤苗刺激的A3組各組均按2.5:1.0,5:1,10:1,20:1,40:1的效靶進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)(具體方法見說明書).
　　7.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):取對數(shù)生長期的PC3接種于裸鼠前肩腫部皮下,接種量及裸鼠數(shù)為:治療組、預(yù)防組和陰性對照組均為每只裸鼠4x10}/L,每組6只裸鼠免疫效應(yīng)細(xì)胞接種方法:治療組待6只裸鼠的移植瘤全部長出后于腫瘤處接種DC瘤苗誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)細(xì)胞,每只裸鼠4.8x10'`/L,預(yù)防組先接種DC疫苗誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)細(xì)胞每只裸鼠4.8x10"/L,2d后再于對側(cè)肩腫部皮下接種腫瘤細(xì)胞,在接種免疫效應(yīng)細(xì)胞時,對照組給等體積10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基.
　　觀察:分別于接種各種細(xì)胞后的第1天觀察裸鼠的反應(yīng),然后每3d觀察1次,于移植瘤發(fā)生后的第45天處死所有裸鼠并稱瘤體的重量.
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,采用9檢驗(yàn).
　　結(jié)果
　　1.體外實(shí)驗(yàn):各組各效靶的殺傷效率:A1組大殺傷效率為3.9%,A2組大殺傷效率為33.9%,A3組大殺傷效率為76.6%.
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):預(yù)防組接種PC3后25d內(nèi)6例中無1例發(fā)生移植瘤,第30天6例中有1例發(fā)生移植瘤,第45天6例中仍只有1例發(fā)生移植瘤,對照組和治療組接種PC3后于第12天全部發(fā)生移植瘤,觀察至45d,所有裸鼠存活.給予免疫效應(yīng)細(xì)胞后的第45天處死所有裸鼠,取出瘤體,稱瘤體重量,各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),對照組分別與預(yù)防組、治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<o.oy,預(yù)防組和對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05.對照組、治療組無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,治療組有1例肉眼可見腫瘤浸潤,預(yù)防組無腫瘤浸潤,對照組腫瘤破潰4例,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移3例,并均有腫瘤浸潤討論當(dāng)今,瘤苗研究主要的工作是在體外培養(yǎng)擴(kuò)增DC,利用抗原或抗原多膚沖擊致敏,然后將致敏DC回輸或免疫接種至荷瘤宿主體內(nèi)進(jìn)行免疫治療腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載DC是目前致敏DC的主要方法之一介,而壞死或死亡的腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC是常用的腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載DC的方法,本實(shí)驗(yàn)以30Gy照射過的胰腺癌細(xì)胞PC3與DC融合產(chǎn)生DC瘤苗,并進(jìn)行體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)收到良好效果.
　　

　　體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DC瘤苗所誘導(dǎo)的群體免疫效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率高于DC疫苗誘導(dǎo)群體免疫效應(yīng)細(xì)胞及無DC誘導(dǎo)的群體免疫效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率.裸鼠實(shí)驗(yàn)可見治療組與對照組比較,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且治療組無腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,6例中僅1例腫瘤浸潤,而對照組腫瘤破潰4例,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移3例,并均有腫瘤浸潤,可以確定DC瘤苗能更有效地誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤的抑制作用;在預(yù)防實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)預(yù)防組接種PC3后Zsa內(nèi)6例中無1例發(fā)生移植瘤,第30天6例中有1例發(fā)生移植瘤,可以認(rèn)為DC瘤苗在預(yù)防腫瘤的發(fā)生中有一定作用.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DC瘤苗誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤的抑制效果比DC疫苗誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤的抑制效果好.
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