活化Chk1引起的G2/M期阻滯在調(diào)節(jié)K562/A02細(xì)胞耐藥中的機(jī)制探討

　　作者：王海燕　張敏　鄒萍　游泳　郭靜明　唐曉瓊　　作者單位：三峽大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院、宜昌市中心人民醫(yī)院血液科， 宜昌 443003; 1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，武漢 430022

　　【摘要】本研究探討活化的Chk1對(duì)白血病細(xì)胞周期及凋亡的影響，探究Chk1調(diào)控腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制。以慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562及其耐藥細(xì)胞系K562/A02(耐阿霉素)為研究對(duì)象,與阿霉素共孵育后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，RT-PCR檢測(cè)Chk1mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Chk1磷酸化水平;靶向Chk1shRNA抑制細(xì)胞內(nèi)Chk1的表達(dá)后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)阿霉素作用后細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明：阿霉素致K562/A02細(xì)胞阻滯在G2/M期的細(xì)胞百分率為(54.12±0.57)%，顯著高于K562細(xì)胞(36.99±1.28)%; Chk1mRNA表達(dá)水平在K562與K562/A02細(xì)胞間無(wú)顯著差異; Chk1磷酸化水平在K562/A02細(xì)胞為0.79 ± 0.56，在K562細(xì)胞為0.27 ± 1.47，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染Chk1shRNA后，兩株細(xì)胞的Chk1磷酸化水平顯著下降。轉(zhuǎn)染組K562、K562/A02細(xì)胞凋亡率分別是空載體轉(zhuǎn)染組的1.30倍和3.84倍。結(jié)論： Chk1的活化水平調(diào)控著K562/A02細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。
　　【關(guān)鍵詞】 Chk1　 G2/M期阻滯　 K562細(xì)胞　 K562/A02細(xì)胞　RNA干擾　 白血病細(xì)胞耐藥

　　Mechanism of G2/M Blockage Triggered by Activated-Chk1 in Regulation of Drug-resistance in K562/A02 Cell LineWANG Hai-Yan, ZHANG Min， ZOU Ping, YOU Yong, GUO Jing-Ming, TANG Xiao-Qiong, ZHAO Zhi-Gang, WU Yao-HuiDepartment of Hematology, Yichang Central People Hospital, The First Clinical Medical College, Three Gorges University, Yichang 443003, China; 1Department of Hematology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China

　　AbstractThe study was purposed to investigate the effect of phosphorylated-chk1 on cell cycle and apoptosis of human erythroleukemic cell line K562 and K562/A02, and to explore the mechanism of chk1 in regulation of drug-resis-tance of leukemia cells. After treatment with adrimycin for six hours, the cell cycle distribution was detected by flow cytometry; the Chk1mRNA ex[x]pression was detected by RT-PCR and the Chk1 phosphorylation level was detected by Western blot. Under the condition of down-regulation of Chk1mRNA ex[x]pression in cells transfected with Chk1 short hairpin RNA, the cell apoptosis rates were detected by flow-cytometry following adrimycin. The results indicated that the proportion of K562/A02 cell line in G2/M phase was (54.12±0.57)% at 6 hours after drug treatment, significantly higher than that of K562 cell line (36.99±1.28)%. No evident difference of the Chk1mRNA ex[x]pression was observed between K562 and K562/A02 cell lines, while elevated Chk1 phosphorylation following DNA damage induced by adriamycin was observed in the K562/A02 cell line (0.79 ± 0.56), significantly higher than that in K562 cell line (0.27 ± 1.47). The cell apoptosis rate of the Chk1 shRNA group in K562/A02 cell line was 3.84-fold of blank vector group, but that in K562 cell line was 1.30-fold of blank vector group. It is concluded that the increased chk1 activity that delay the progress of cell cycle are associated with cellular resistance to adrimycin in the K562/A02 cell line.

　　Key wordsChk1; G2/M arrest; K562 cell; K562/A02 cell line; RNA interference; leukemia cell drug-resistance

　　細(xì)胞周期G2/M檢測(cè)點(diǎn)是監(jiān)控細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期的重要關(guān)卡。當(dāng)放療及化療等因素致細(xì)胞DNA雙鏈斷裂(double strand breaks, DSB)后，三磷酸肌醇激酶的激酶(PIKK)家族成員ATR識(shí)別受損的DNA，將損傷信號(hào)通過(guò)其下游的因子如H2AX、
　　NBS1、BRCA1傳遞給細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶，從而使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，修復(fù)受損的DNA，使其繼續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期;如損傷廣泛，則誘導(dǎo)凋亡。已有研究表明，化療藥物順鉑、絲裂霉素C引起的G2/M期阻滯延長(zhǎng)與腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)有關(guān)[1];而且，原發(fā)耐藥的腫瘤細(xì)胞本身具有阻滯在G2/M期的能力，且在此期延長(zhǎng)[2]。這些結(jié)果表明，G2/M期檢測(cè)點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞耐藥中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase1, Chk1)是調(diào)控G2/M期檢測(cè)點(diǎn)主要效應(yīng)分子之一。我們前期的研究表明，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制Chk1在K562/A02細(xì)胞中的表達(dá)，解除了G2/M期阻滯，增強(qiáng)了阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這說(shuō)明了Chk1參與了K562/A02細(xì)胞的耐藥。但Chk1是如何影響腫瘤細(xì)胞的耐藥特性尚不清楚，對(duì)此本研究作了進(jìn)一步探討。
　　材料和方法
　　材料和試劑
　　K562細(xì)胞系敏感株K562、多藥耐藥株K562/A02為本室保存株。攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的RNAi真核表達(dá)載體pEGFP-H1和針對(duì)Chk1基因的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)pEGFP-H1/Chk1shRNA均由本室構(gòu)建并經(jīng)測(cè)序證實(shí)。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自MBI公司，Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京天為時(shí)代生物公司。質(zhì)粒小量柱式抽提試劑盒購(gòu)自上海華順生物公司。人β-actin和Chk1引物由上海生物工程公司合成。G418、碘化丙錠(PI)購(gòu)自Sigma公司。兔抗人Chk1磷酸化抗體(S345)購(gòu)自Cell Signaling公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為北京中山生物工程公司產(chǎn)品。AnnexinV-cy5凋亡試劑盒購(gòu)自Becton Dickinson公司。
　　方法

　　細(xì)胞培養(yǎng)K562、K562/A02于含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2、水飽和濕度條件下培養(yǎng)。以常規(guī)方法誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞的耐藥性[ 3]，并于實(shí)驗(yàn)前兩周置于普通培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。
　　細(xì)胞周期分析分別收集阿霉素(1 μg/ml)作用后6小時(shí)、24小時(shí)的K562、K562/A02兩組細(xì)胞各1×106個(gè)，設(shè)未經(jīng)藥物處理的空白對(duì)照組，以冰凍的PBS洗2次，70%的乙醇4℃固定過(guò)夜，離心去上清，PBS洗2次后，加入0.3 ml 20 μg/ml的PI(含0.2 mg/ml RNA酶)染色，室溫避光30分鐘，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布。
　　半定量RT-PCR分別收集阿霉素處理6小時(shí)后各組細(xì)胞2×106 個(gè)，TRIZOL試劑提取其總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的含量，以3 μg RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參照。β-actin 的PCR引物序列為：上游引物5'-TGTACGTTGCTATCCAGGCT-3'，下游引物5'-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度241 bp。Chk1 的PCR引物序列為：上游引物5'-TGAAGCCGGCCGTAGACT-3'，下游引物5'-TCCACAGGACCAAACATC-3'。PCR的擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3分鐘, 95℃變性1分鐘, 55℃退火50秒, 72℃延伸1分鐘，這3步循環(huán)30次，72℃延伸5分鐘。產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。
　　Chk1磷酸化水平Western blot檢測(cè)細(xì)胞分組處理同上，按照參考文獻(xiàn)[4]提取蛋白樣品，每泳道以10 μl作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，BSA封閉1小時(shí), 一抗為兔抗人Chk1-S345(1∶1 000)，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔，以β-actin為內(nèi)參，經(jīng)ECL系統(tǒng)顯色，掃描后用BandScan軟件分析，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶的光密度比值。
　　細(xì)胞轉(zhuǎn)染 、鑒定K562和K562/A02細(xì)胞各分組如下： ①未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、②PEGFP-H1空載體轉(zhuǎn)染組、③PEGFP-H1/Chk1轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/ml，在560 V，60 μs，電擊1次的條件下行電穿孔轉(zhuǎn)染(Eppendorf電轉(zhuǎn)儀，購(gòu)自基因公司)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24-48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。并在培養(yǎng)液中加入G418(終濃度400 μg/ml)篩選穩(wěn)定株。實(shí)驗(yàn)前，換用不含G418的培養(yǎng)液，細(xì)胞處理和方法同Western blot。
　　細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞分組同細(xì)胞轉(zhuǎn)染、鑒定，收集阿霉素誘導(dǎo)凋亡6小時(shí)后的各組細(xì)胞和未處理的空白對(duì)照組，PBS洗2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，分別經(jīng)AnnexinV-cy5標(biāo)記后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行分析，所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，配伍組間比較采用多因素方差分析， P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Table. Effect of adrimycin(1 μg/ml) on cell cycle distribution of the K562 and K562/A02 cell lines(略).

　　結(jié)果

　　細(xì)胞周期的分布
　　阿霉素作用6小時(shí)后，K562細(xì)胞分布在G2/M期的百分率為(36.99 ± 1.28)%，K562/A02為(54.11 ± 0.57)%，兩者差異有顯著性(P<0.05)，提示在耐藥細(xì)胞株中G2/M期的阻滯明顯延長(zhǎng)，且于6小時(shí)阻滯在G2/M期的細(xì)胞較高(附表) 。
　　Chk1mRNA水平在K562和K562/A02間的表達(dá)差異

　　由PCR電泳可見(jiàn)，β-actin與Chk1分別位于241 bp和461 bp處(圖1)，通過(guò)凝膠圖像分析儀掃描Chk1與β-actin條帶的光密度比值：K562細(xì)胞為0.82±0.76，K562/A02為0.86±1.41，可見(jiàn)Chk1mRNA水平的表達(dá)在兩株細(xì)胞內(nèi)無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　Chk1磷酸化水平在K562和K562/A02間的表達(dá)差異

　　Weston-blot分析顯示,K562/A02細(xì)胞的Chk1磷酸化水平顯著高于K562細(xì)胞(圖2)，掃描電泳條帶的灰度比值分別為0.79 ±0.56和0.27 ± 1.47，兩者差異有顯著性(P<0.05)， Chk1的活化水平與G2/M期細(xì)胞的百分比呈正相關(guān)。
　　Chk1shRNA對(duì)Chk1磷酸化水平的影響

　　轉(zhuǎn)染Chk1shRNA的細(xì)胞，由于shRNA靶向抑制了Chk1mRNA表達(dá)，使磷酸化水平下降。K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染組的Chk1磷酸化水平較空載體組下降73%，而K562/A02細(xì)胞轉(zhuǎn)染組的Chk1磷酸化水平較空載體組下降85%，Chk1shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與空載體組、未轉(zhuǎn)染組相比有顯著差異(P<0.05)，但轉(zhuǎn)染組細(xì)胞K562與 K562/A02兩者間無(wú)顯著差異(圖3)。
　　細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
　　應(yīng)用Annexin V-cy5凋亡試劑盒檢測(cè)上述各組細(xì)胞的早期凋亡發(fā)現(xiàn)，阿霉素處理6小時(shí)后，K562、K562/A02細(xì)胞空載體組的凋亡率分別為42.13% ± 1.12%、5.43 % ± 1.25%,而shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在阿霉素作用6小時(shí)后，K562、K562/A02細(xì)胞凋亡率分別是空載體組的1.30倍和3.84倍，可見(jiàn)下調(diào)Chk1的表達(dá)后， K562/A02細(xì)胞凋亡率上升更顯著(P<0.05)(圖4)。
　　討論

　　腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，其中一個(gè)重要機(jī)制是細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的活化參與了耐藥的形成。尤其是G2/M期檢測(cè)點(diǎn)的活化，其作用尤為突出，因?yàn)?① 許多抗腫瘤藥物作用于細(xì)胞周期; ②絕大部分腫瘤細(xì)胞具有獲得性的G1/S期檢測(cè)點(diǎn)缺陷，而依賴(lài)于G2/M期檢測(cè)點(diǎn)的保護(hù)功能，腫瘤細(xì)胞的這種特性使其有別于正常細(xì)胞，也提示G2/M期檢測(cè)點(diǎn)是一個(gè)潛在的腫瘤治療的特異性靶點(diǎn)[5]; ③與多藥耐藥相關(guān)的P糖蛋白(Pgp)的逆轉(zhuǎn)劑除了增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度外，其細(xì)胞毒作用也與G2/M期的阻滯解除有關(guān)[6]。因此，與G2/M期阻滯相關(guān)的細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶Chk1、Chk2起重要作用。但有文獻(xiàn)報(bào)道，在P53缺陷的腫瘤細(xì)胞中，是Chk1而非Chk2參與了細(xì)胞的損傷反應(yīng)[7]，故探討Chk1在腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制中的調(diào)控尤為重要。 本研究發(fā)現(xiàn)，在阿霉素誘導(dǎo)下，耐藥細(xì)胞株K562/A02的G2/M期阻滯明顯較敏感細(xì)胞株K562延長(zhǎng), 這一現(xiàn)象與Chk1磷酸化水平升高密切相關(guān)，但與Chk1mRNA表達(dá)水平無(wú)關(guān);下調(diào)Chk1的表達(dá)后，K562/A02細(xì)胞凋亡率增加了近3倍，較K562細(xì)胞增加顯著，此結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較為一致[4，8]。因此，活化的Chk1通過(guò)延遲細(xì)胞進(jìn)入有分裂期以修復(fù)受損的DNA，從而提高細(xì)胞的增殖活性，且活化水平的高低使不同的細(xì)胞表現(xiàn)為程度不一的抗藥性;而G2/M期阻滯的解除更有利于增強(qiáng)DNA損傷劑對(duì)耐藥細(xì)胞的殺傷活性。上述結(jié)果表明，Chk1磷酸化水平是影響腫瘤細(xì)胞耐藥性的重要因素。但它又是如何影響隨后的DNA修復(fù)及修復(fù)后細(xì)胞周期的恢復(fù)，其機(jī)制尚不清楚。故對(duì)此方面研究將為闡明腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制提供有意義的材料。此外，本課題將質(zhì)粒載體構(gòu)建的Chk1shRNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)高效轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)了良好的抑制效果。與反義寡核苷酸和Chk1小分子抑制劑(咖啡因、UCN01等)相比，RNA干擾(RNA interference, RNAi)誘導(dǎo)的基因沉默顯示了其高穩(wěn)定性、高效率性、高特異性、高穿透性、低毒性等優(yōu)點(diǎn)，使其在腫瘤基因治療中有著良好的應(yīng)用前景[9]?？傊?，細(xì)胞周期G2/M檢測(cè)點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞有別于正常細(xì)胞的一個(gè)保護(hù)機(jī)制，因此對(duì)于其效應(yīng)分子—Chk1在白血病細(xì)胞耐藥機(jī)制中作用的研究將為難治性、復(fù)發(fā)性白血病的治療提供新的靶點(diǎn)，而RNA干擾技術(shù)與常規(guī)抗腫瘤治療結(jié)合可能為克服腫瘤細(xì)胞耐藥提供新的有效治療途徑。