腫瘤生物樣本庫的標(biāo)準(zhǔn)化建立與管理

          腫瘤是中國(guó)乃至全球常見、病死率高的疾病之一。腫瘤組織是人類對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行探索的直 接、具體的研究對(duì)象，為了能夠系統(tǒng)的收集、管理、并且有效 利用這些腫瘤組織，建立腫瘤組織樣本庫( tumor tissue bank， TTB)。胡。腫瘤組織樣本庫的建立能夠系統(tǒng)、規(guī)范、科學(xué)收集、 保存手術(shù)切除的腫瘤組織、采集腫瘤患者相關(guān)體液及匯總相關(guān) 病理類型、臨床分期和治療效果等方面信息的平臺(tái)[34]。本院 腫瘤組織樣本庫自2012年成立以來，在臨床科室、麻醉科、手術(shù)室的大力配合下已經(jīng)初具規(guī)模，初步形成組織樣本的標(biāo)準(zhǔn)化 收集、儲(chǔ)存和管理的體系，已經(jīng)收集各類手術(shù)中產(chǎn)生的組織樣 本包括腫瘤組織、癌旁組織、遠(yuǎn)端正常組織、正常組織和各類體 液樣本。隨著腫瘤組織樣本庫的發(fā)展，也出現(xiàn)了許多問題，作 者就現(xiàn)在組織樣本庫目前的問題進(jìn)行探討，以期有助于樣本庫 標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的發(fā)展。 
          1 腫瘤組織樣本庫的現(xiàn)狀及建立的意義近幾年，生物樣本庫的發(fā)展日新月異，世界上很多發(fā)達(dá)國(guó) 家已經(jīng)建立了自己的腫瘤組織樣本庫，并且還漸形成了規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；捏w系。知名度比較大的包括日本生物樣 本庫( biobank Japan)，其主要特點(diǎn)是收集住院患者組織和普通 人群，側(cè)重常見疾病的研究及藥物實(shí)驗(yàn)。歐洲生物樣本庫(biobanking and biomolecular resources reasearch infrastruc-ture)，其主要特點(diǎn)是網(wǎng)絡(luò)型樣本庫、包括歐盟24國(guó)家超過200個(gè)機(jī)構(gòu)，目前已經(jīng)存有樣本量大于1千萬份。新加坡組織網(wǎng)絡(luò)( singapore tissue network)，其主要特點(diǎn)是收集組織與DNA樣 本，為特定研究項(xiàng)目收集提供樣本。英國(guó)生物樣本庫(UKbiobank)，啟動(dòng)于2006年，主要收集普通人群樣本。在我國(guó)， 近幾年我國(guó)一些醫(yī)院也相繼成立了樣本庫，比如天津腫瘤醫(yī)院、中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院、北京腫瘤醫(yī)院。與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，有優(yōu) 勢(shì)，也存在很多劣勢(shì)。優(yōu)勢(shì)在于我國(guó)地大物博，人口眾多，疾病 的種類也十分繁多，資源豐富，每年腫瘤發(fā)病病例約200萬例， 死亡病例約150萬例。我國(guó)生物樣本庫的劣勢(shì)主要是每個(gè)樣 本庫都是以個(gè)體為中心，缺乏規(guī)范化的管理，缺乏資源的共享，對(duì)組織樣本不能有效的利用，導(dǎo)致資源的浪費(fèi)。建立生物樣本 庫酌意義是為了整合資源，應(yīng)用于以包括流行病學(xué)、疾病的分 子病理機(jī)制、發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后分析、個(gè)性化治療方案的建立、 療效的隨訪、藥物敏感性研究及新藥開發(fā)等的研究。 
          2建立標(biāo)準(zhǔn)化的生物樣本庫 
          2.1標(biāo)準(zhǔn)化的采集和儲(chǔ)存生物樣本標(biāo)準(zhǔn)化的采集組織樣本 是組織樣本庫的核心內(nèi)容，是獲得穩(wěn)定、可靠的科研結(jié)果的保障。按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化操作程序(standard operation procedure， SOP)，樣本庫建立的基本工作流程如下：(1)獲得所在醫(yī)療機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。(2)手術(shù)前同患者簽署樣本留取知情同意 書。(3)向手術(shù)室和病理科提交樣本收集申請(qǐng)。(4)手術(shù)中切除的樣本置于冰盒里迅速送至病理科，病理科對(duì)組織進(jìn)行常規(guī)的登記，樣本庫技術(shù)人員在保證病理診斷的前提下進(jìn)行取材， 存人樣本庫的組織包括腫瘤組織、癌旁組織、遠(yuǎn)端正常組織和良性組織。(5)每天手術(shù)結(jié)束后將ld收集的樣本用液氮罐轉(zhuǎn)運(yùn)回樣本庫放入-80℃冰箱長(zhǎng)期保存，做好電子版和紙質(zhì)版 登記備份。組織樣本取材與儲(chǔ)存的注意事項(xiàng)：(1)需要嚴(yán)格控制低溫時(shí)間，手術(shù)中取出組織從離體到凍存所需時(shí)間差越短越好。TuBa Frost的標(biāo)準(zhǔn)是30～120 min，主要目的是盡量縮短組織缺血的咐間，保證細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，減少組織的降解。 保證上述的要求需要外科醫(yī)生、病理醫(yī)師和技術(shù)人員的密切配 合。研究指出組織取出后5～10 min內(nèi)冷凍，基因就已經(jīng)開始 改變；15 min后有10%～15%的基因改變；30 min后有20%以 上的改變朝。但也有研究表明，基因表達(dá)的改變與組織從取出到冷凍之間的時(shí)間間隔并無直接關(guān)系，然而為了保證樣本質(zhì)量，期間時(shí)間間隔還是愈短愈好。經(jīng)過許多實(shí)驗(yàn)室反復(fù)實(shí)驗(yàn)論證，組織離體后20 min內(nèi)凍存的樣本可獲得比較穩(wěn)定的基 因表達(dá)‘明。(2)凍存組織取材大小5 mm×5 mm×5 mmL7]。 (3)為避免組織交叉污染。每次取材應(yīng)使用干凈、消毒的器械， 取正常和腫瘤組織要使用兩套不同器械。(4)長(zhǎng)期儲(chǔ)存組織應(yīng) 放于-80℃冰箱或液氮罐內(nèi)可保證組織的質(zhì)量，溫度越低組織 保存的時(shí)間越長(zhǎng)，但也有研究分析指出-80℃長(zhǎng)期保存的組 織DNA比較穩(wěn)定，保存期超過5年RNA就有所改變。放置于氣態(tài)的液氮罐中的組織超過10年，RNA也相對(duì)穩(wěn)定。 (5)樣本庫技術(shù)人員都要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，認(rèn)真學(xué)習(xí)相關(guān)病理知 識(shí)、手術(shù)室無菌操作規(guī)范，并且佩戴專業(yè)保護(hù)裝置，如手套、護(hù)目鏡等，同時(shí)要避免感染艾滋病、肝炎、結(jié)核籌。 
          2.2 樣本的質(zhì)量控制 低溫凍存被為是組織與器官長(zhǎng)期

          保存有效的方法。其原理是通過降低細(xì)胞的代謝率起到保 護(hù)組織細(xì)胞的作用。對(duì)于低溫樣本的質(zhì)量控制可直接影響組織樣本的使用效率，為了更加有效的利用這些組織樣本，此程 序主要由樣本庫技術(shù)人員進(jìn)行嚴(yán)格把關(guān)。樣本庫技術(shù)人員在病理科人員的協(xié)助下共同取材，并對(duì)所取組織樣本進(jìn)行病理學(xué)鑒定，若組織切片中腫瘤成分超過75%則認(rèn)為質(zhì)量良好，如不足65%則可能影響研究結(jié)果[89]。對(duì)儲(chǔ)存于生物樣本庫的病例應(yīng)進(jìn)行定期臨床隨訪，以便獲得疾病治療效果、臨床進(jìn)展及是否生存等重要資料。對(duì)于低溫冰箱應(yīng)做好日常的維護(hù)工作，定時(shí)記錄低溫冰箱的溫度，并且在樣本庫所在房間配備雙電源及低溫冰箱報(bào)警系統(tǒng)來確保樣本的安全。對(duì)于液氮罐需要隨時(shí)檢查液氮量。眾多研究顯示，長(zhǎng)期凍存對(duì)于DNA大分子的穩(wěn)定性影響不大，甚至石蠟包埋組織塊中的DNA也可進(jìn)行分 子生物學(xué)分析。RNA分子則易被廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)、皮膚、唾液、汗液及周圍環(huán)境中的RNA酶所降解。使用液氮保存是保 存RNA活性的理想方法，當(dāng)溫度降至液氮溫度時(shí)，細(xì)胞 組織中所有的生物化學(xué)、生物物理過程均處于停止?fàn)顟B(tài)但限 于空間及經(jīng)費(fèi)等原因，大型液氮儲(chǔ)藏罐或液氮冰箱尚難以推廣 普及。 
          2.3樣本的信息化簪理組織樣本的科學(xué)價(jià)值并不只是在于 其是采用先進(jìn)的方法采集，高質(zhì)量的冷凍和存儲(chǔ)，更在于其相 應(yīng)保存了完整的臨床數(shù)據(jù)。重慶醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院利用定制的生物樣本庫管理軟件對(duì)在庫的組織樣本進(jìn)行系統(tǒng)、規(guī)范 的管理。樣本庫管理軟件的主要特點(diǎn)：(1)采用個(gè)性化設(shè)置，可根據(jù)所在機(jī)構(gòu)對(duì)樣本信息的需求自定義軟件。本庫根據(jù)自身 定制的樣本庫管理軟件包括以下3個(gè)方面信息：病案信息、病歷信息、樣本信息。病案信息包括患者姓名、性別、生日、年齡、 隨訪信息，影像信息、聯(lián)絡(luò)方式、身份證號(hào)；病歷信息包括手術(shù)日期、手術(shù)科別、手術(shù)醫(yī)生、手術(shù)名稱、臨床診斷、腫瘤的TNM分期；樣本信息包括樣本種類、次級(jí)分類、是否原發(fā)、轉(zhuǎn)移、腫瘤 性質(zhì)、樣本質(zhì)地、樣本顏色、取材員姓名、組織的離體時(shí)間、取材 時(shí)間、低溫時(shí)間、有無化療以及化療方案。
          

          樣本庫管理軟件可 以自行設(shè)計(jì)凍存設(shè)備包括-80℃低溫冰箱、液氮罐，可根據(jù)本 庫低溫冰箱的內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)儲(chǔ)存方式，并且準(zhǔn)確定位冰箱里的 組織樣本，另一個(gè)特色就是該軟件可以采用組合查詢的方式進(jìn)行樣本的檢索，即可以根據(jù)科研人員的課題研究的需要，自定義組合查詢條件來找到所需要的樣本，樣本庫技術(shù)人員將出庫組織樣本所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)反饋馬生物樣本庫管理軟件。(2)樣本庫管理軟件網(wǎng)絡(luò)化。為了進(jìn)一步保證樣本庫信息的安全 性，本庫采用網(wǎng)絡(luò)化對(duì)樣本庫信息進(jìn)行管理。主要包括使用客戶端和服務(wù)器分開，保證樣本庫信息的多地備份，以防止在出 現(xiàn)電腦損壞或者其他不可預(yù)知情況下能夠保證樣本庫信息的安全。并且在醫(yī)院網(wǎng)絡(luò)部門和樣本庫軟件設(shè)計(jì)公司的配合下， 實(shí)現(xiàn)了樣本庫軟件和醫(yī)院信息管理系統(tǒng)( hospital informationsystem，HIS)的對(duì)接，即輸入患者的住院號(hào)，軟件就可以自動(dòng) 從HIS系統(tǒng)中讀取到患者的病案和病歷信息。此項(xiàng)功能的開通不僅很大程度上提高了工作的效率，也減少了因?yàn)槿藶橐蛩?造成的樣本信息錄入錯(cuò)誤。 
          3生物樣本庫的前景與挑戰(zhàn) 隨著表觀遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，基因治療已經(jīng)成為 腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，對(duì)組織樣本的需求也越來越大，生物樣本庫的作用也越來越明顯。隨著研究的日益深入，對(duì)生物樣本庫的要求也越來越高。高水平的生物樣本庫不僅需要 高質(zhì)量的生物樣本還應(yīng)該有與之匹配的完整的信息數(shù)據(jù)庫，達(dá) 到這一要求需要手術(shù)醫(yī)生、病理科醫(yī)生和樣本庫工作人員的共同努力。我國(guó)人口眾多，疾病種類也相當(dāng)復(fù)雜，應(yīng)該采用更加科學(xué)的方式有效，合理地收集人類腫瘤樣本贅源，為科研工作 者搭建一個(gè)平臺(tái)，為未來腫瘤患者的個(gè)性化治療提供幫助。 
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          （收稿日期：2014-0320修回日期：2014-0609）