燙傷大鼠中樞氨基酸遞質和心血管功能改變的關系

　　關鍵字： 心血管功能
　　燒傷早期(休克期)的機制復雜，影響心血管功能衰竭的外周因素，如血流動力學、內毒素、細胞因子等已有報道[1～3]，而中樞機制是其改變的重要調控環(huán)節(jié)。中樞氨基酸遞質是對心血管活動起重要調節(jié)作用的神經遞質[4，5]，下丘腦是調節(jié)心血管活動的主要皮質下中樞，氨基酸遞質豐富。本研究擬觀察燙傷大鼠早期下丘腦氨基酸遞質的變化，以及它們對大鼠心血管指標的影響，為燒傷休克的機制研究提供新的實驗資料。
　　1　材料和方法
　　1.1　主要試劑和藥品　γ-氨基酸(GABA)，印防己毒素(PT)均為Sigma公司產品;3H-GABA由上海原子核研究所提供，比活性：35.12Bq/mg;海人酸(KA)由南京大學生化系提供。
　　1.2　動物分組及燒傷模型制備　SD大鼠(分別由南京大學實驗動物中心和長海醫(yī)院實驗動物中心提供)，雄性，體質量200～250g，燙傷后隨機分為3組：下丘腦氨基酸遞質測定組、下丘腦GABA受體測定組和側腦室給藥組，3組均設相應平行對照組。藥物為GABA受體拮抗劑PT和谷氨酸受體激動劑KA，注入量均為10μl，濃度均為0.1mmol/L。大鼠俯臥于鼠板上，背部剃毛，100℃水燙20s，形成30% TBSA Ⅲ度燙傷模型。
　　1.3　下丘腦氨基酸遞質測定　參照南京大學生化系腦組織氨基酸相對含量測定方法。步驟如下：大鼠斷頭后立即投入液氮中冷凍，30min后取下丘腦，稱量后放入裝有預冷的75%乙醇勻漿器中2000r/min勻漿30s，倒入蛇型回流冷凝器，90℃水浴加熱10min，置離心管內4000r/min離心20min，上清液在90℃水浴中加熱蒸發(fā)乙醇，冷卻后倒入球型分液漏斗，加無水乙醚10ml，振蕩后靜置10min，下層水相液體放入三角燒杯，40℃水浴蒸發(fā)乙醚，并用干燥箱在60℃抽干備用。測定時將標本用1.0mol/L HCl和0.1mol/L NaOH定容，充分攪伴后取10μl，置氨基酸自動化分析儀中分析氨基酸色譜。分析柱：4mm×150mm，樹脂：2619型;脫氨柱：4mm×50mm，樹脂：2950型;柱溫：53℃，洗脫液泵1∶0.225ml/min，茚三酮泵2∶0.3ml/min。分析程序為12min標準蛋白質水解液程序。根據氨基酸峰面積計算氨基酸相對含量。
　　1.4　下丘腦GABA受體測定　采用神經元突觸膜放射配基結合測定法檢測下丘腦GABA受體的大結合容量(Bmax)和平衡解離常數(Kd)值。
　　1.4.1　突觸膜制備　剪頭，取下丘腦置于冷生理鹽水中，按腦∶蔗糖為1∶4比例加入0.32mol/L蔗糖(去蛋白)，標本勻漿管置于冰水中電動勻漿(8檔，上下7～8次，約2min)，勻漿液分裝，以0.32mol/L蔗糖配平質量，放入低溫離心機，以1500r/min離心10min，取上清液(內含膜)，分裝配平，放入低溫離心機，以1×104r/min離心20min，去上清液，留沉淀物(內含膜)，沉淀物中加入10mmol/L Tris-HAc溶液1ml，放入低溫離心機，以1×104r/min離心20min，去上清液，再留沉淀物，再加入10mmol/L Tris-HAc溶液配平質量，1×104r/min離心20min，去上清液，留沉淀物加適量Tris-HAc溶液冷凍保存。
　　1.4.2　加樣　設雙復管，每管內加入不同濃度的放射配基(3H-GABA)和定量膜蛋白(約100μg)，平行的非特異管再加入抑制劑(非標記的GABA)，用Tris-HAc緩沖液補足至總反應體積為500μl，25℃孵育振蕩60min，以預冷的Tris-HAc緩沖液(pH7.4)終止反應，立即用49型玻璃纖維濾紙抽濾，用預冷的Tris-HAc溶液洗滌、抽濾，取下濾膜置于閃爍瓶內，烘箱內烘干待測。
　　1.4.3　檢測　閃爍瓶中加5ml閃爍液，用美國Beckman LS-9800型液體閃爍儀計數。蛋白質量濃度用考馬斯亮藍法測定，按Scatchard作圖法，計算出大結合容量Bmax和平衡解離常數Kd值。
　　1.5　大鼠側腦室給藥方法　根據Pellegrino圖譜的定位方法，將大鼠固定在立體定向儀上，按側腦室位置在顱骨上鉆孔(以顱骨矢狀縫、冠狀縫交點為原點，孔中心位于原點向左旁開1.6mm處，前后不移動)，將側腦室套管垂直埋入并固定，用10μl微量注射器將藥物注入，實驗結束后作腦切片證實套管位置是否正確。
　　1.6　記錄心血管指標　導管分別插入股動脈和經頸總動脈插入左心室，與壓力-電壓換能器相連，由四導生理儀放大后記錄平均動脈壓(MAP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室內壓大變化速度(±dp/dtmax)。各項指標以燙前水平為，觀察燙傷大鼠注射藥物后2h各指標的相對變化。
　　1.7　統(tǒng)計學處理　實驗數據以±s表示，采用t檢驗。
　　2　結　果
　　2.1　燙傷大鼠側腦室注入PT和KA對心血管指標的影響　燙傷大鼠側腦室注入PT可較顯著地阻擋其心血管指標的下降趨勢，注入KA對心血管指標也有一定的影響。
　　2.2　燙傷大鼠下丘腦氨基酸遞質含量的改變　與對照組相比，GABA含量在傷后1h已有升高，傷后2 h則明顯升高(P<0.05);谷氨酸含量在燙傷后1，2h有所降低;其他氨基酸遞質含量無明顯改變(表2)。
　　2.3　燙傷大鼠下丘腦GABA受體的改變　與對照組相比，燙傷組高親和力GABA受體和低親和力GABA受體的Bmax均明顯增加(P<0.05)，但Kd值無明顯改變。
　　3　討　論
　　燒傷休克是一類影響因素較為復雜的循環(huán)休克，其心血管功能狀態(tài)對它的轉歸有直接影響?，F已證明中樞GABA對心血管活動有抑制作用，谷氨酸有興奮作用。本實驗室還觀察到下丘腦室旁核的GABA遞質對燙傷大鼠血壓有明顯影響[6]。本研究在此基礎上較深入地探討了中樞GABA、谷氨酸等氨基酸遞質對大鼠燙傷早期的心血管功能的影響。結果表明，燙傷早期大鼠下丘腦GABA含量明顯增加，谷氨酸含量有所降低，其他氨基酸遞質含量無明顯變化，GABA受體Bmax也明顯增加;進一步在側腦室注入PT和KA拮抗GABA和激活谷氨酸作用，發(fā)現可以明顯阻止大鼠的心血管功能指標下降趨勢。以上結果說明燙傷大鼠早期心血管功能減退，不僅和外周因素有關，而且可能和下丘腦調控心血管活動的GABA及谷氨酸遞質變化有關。
　　燙傷大鼠早期下丘腦氨基酸遞質的調控變化機制尚不清楚。我們推測可能由于燙傷早期機體應激代償反應引起中樞各遞質系統(tǒng)的激活或抑制，而遞質系統(tǒng)之間的相互影響、作用，改變它們彼此的分泌、釋放和代謝。
　　以上分析提示，大鼠燙傷早期中樞GABA及谷氨酸遞質改變可能是其心血管功能減退的影響因素之一，至于它和外周影響因素之間的相互關系，還需進一步研究。