作者:田文艷,張洪義1,蘇立凱,申文增1 作者單位:1 河北大學(xué) (河北大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 保定 071000)
【摘要】目的研究替勃龍對缺血性腦損害的神經(jīng)保護(hù)作用及可能機制。方法 30只雌性成年SD大鼠,隨機分為假手術(shù)組,模型組,替勃龍組;采用大鼠大腦中動脈閉塞制成局灶性腦缺血模型。在缺血2 h、再灌注24 h后立即斷頭取腦,應(yīng)用TTC染色觀察腦梗死體積,TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞數(shù),免疫組化法檢測Bcl2以及白介素(IL)1β和腫瘤壞死因子(TNF)α的表達(dá),并進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。結(jié)果 替勃龍組較模型組腦梗死體積顯著縮小(P<0.05);TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)少(P<0.01);Bcl2陽性細(xì)胞增多(P<0.01);IL1β及TNFα表達(dá)減弱,差異有顯著性(P<0.01)。結(jié)論 替勃龍可減輕去卵巢大鼠腦缺血再灌注損傷,具有神經(jīng)保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】 替勃龍;腦缺血;凋亡;IL1β;TNFα
【Abstract】 ob[x]jective To study the neuroprotective effect of tibolone and the possible roles during cerebral ischemia injury.Methods 30 healthy adult female Sprague Dawley rats were selected, and randomly divided into shamoperated, ovariectomized, tibolone (2.5 mg·d-1·kg-1) groups.Brain ischemia model was induced by left middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 2 hours, at 24 hours after reperfusion.All animals were killed.Cerebral infarction volume was determined by 2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride (TTC) staining and image analysis.Apoptotic cells were labeled by terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL) .The ex[x]pression of Bcl2 /IL1β/TNFα was analyzed by immunohistochemical method.The changes of tissue pathology were also investigated.Results Cerebral infarction volumes were reduced significantly in tibolone treated groups than thos in ovariectomized group (P<0.05).Tibolone decreased the ex[x]pression of TUNEL (P<0.01), and increased the ex[x]pression of bcl2 (P<0.01).The protein ex[x]pression of IL1β and TNFα in tibolone group decreased obviously compared with those in ovariectomized group (P<0.01).Conclusions Tibolone decreases the injury following cerebral ischemiareperfusion in OVX rats and have neuroprotective effect.
【Key words】 Tibolone; Cerebrovascular Disorders; Apoptosis; IL1β; TNFα
據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究表明,雌激素替代治療能使絕經(jīng)期婦女腦梗死的相對危險度及與相關(guān)死亡率下降〔1〕。替勃龍(tibolone,7甲基異炔諾酮)為一種組織特異性的甾體類固醇,對骨及陰道組織產(chǎn)生雌激素樣作用,但不刺激子宮內(nèi)膜和乳腺組織,不僅能改善更年期癥狀,還可能在老年女性心腦血管疾病預(yù)防及治療方面發(fā)揮有利作用〔2〕。本文旨在探討替勃龍對去卵巢大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷保護(hù)作用及可能機制,為臨床絕經(jīng)后婦女合理應(yīng)用雌激素替代治療提供更多理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
5月齡健康雌性SD大鼠30只,體重250~270 g,由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(動物使用許可證號SCXK20031003)。
1.1.1 實驗動物分組
按體重隨機分為3組:假手術(shù)組、模型組、替勃龍組,各組10只。假手術(shù)組行下腹切開,見到雙側(cè)卵巢,但不切除任何組織;其余兩組于腦缺血術(shù)前14 d切除雙側(cè)卵巢。替勃龍組,替勃龍(荷蘭歐加農(nóng)生產(chǎn),南京歐加農(nóng)制藥分裝)0.25 mg·kg-1·d-1灌胃;假手術(shù)組和模型組每日同等量蒸餾水灌胃。實驗期間所有動物置于同一室內(nèi),二級環(huán)境分籠飼養(yǎng),自由飲水,室溫(21±4)℃,光照12 h,黑暗12 h。
1.1.2 腦缺血再灌注模型制作
用改良Longa法制作大鼠大腦中動脈阻斷(MCAO)模型。以10%水合氯醛麻醉后,暴露并鈍性游離左側(cè)頸總動脈(CCA),結(jié)扎同側(cè)CCA近心端和頸外動脈(ECA)分叉部,距CCA末端約5 mm處剪口,用直徑0.24 mm的日本尼龍線沿頸內(nèi)動脈(ICA)方向插入,深度由分叉部算約 (18.5±0.5)mm,于ICA近心端結(jié)扎該動脈,全層縫合切口,再灌注時抽出尼龍線10 mm。以動物清醒后爬行時向右轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象),嚴(yán)重時向右跌倒,提尾時右前肢內(nèi)收屈曲,為入選標(biāo)準(zhǔn)。于腦缺血手術(shù)2 h后再灌注,24 h后斷頭取腦。
1.2 指標(biāo)檢測及方法
1.2.1 腦梗死體積測定
大鼠腦缺血2 h,再灌注24 h后斷頭取腦。取左側(cè)大腦半球,冠狀面均勻切成2 mm 厚腦片,染色固定,照相測量并計算出總的梗死體積。用計算機多媒體彩色圖像分析系統(tǒng)測量腦梗死體積。
1.2.2 免疫組化及細(xì)胞凋亡的檢測
大鼠腦缺血2 h,再灌注24 h后斷頭取腦,距額極3~5 mm冠狀切取材,放入4%多聚甲醛固定24 h后,制成石蠟切片,用于免疫組織化學(xué)染色。SP法檢測抗凋亡基因Bcl2的表達(dá)以及白細(xì)胞介素1β(IL1β)和腫瘤壞死因子α(TNFα)的表達(dá)。采用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics 公司ImagePro Plus)。在光鏡下圖像分析,每張切片采集缺血周邊區(qū)具有代表性10個高倍視野,計算平均數(shù)。采用缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法原位標(biāo)記DNA片段檢測凋亡細(xì)胞。具體步驟參照產(chǎn)品說明書。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法
應(yīng)用SPSS10.0 統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)以x±s表示,多組間比較進(jìn)行方差分析及兩兩比較q檢驗。
2 結(jié) 果
2.1 梗死體積
兩組梗死體積差異顯著(P<0.05)。見表1。表1 替勃龍對腦缺血模型大鼠梗死體積的影響
2.2 細(xì)胞凋亡
模型組對側(cè)僅見數(shù)個陽性細(xì)胞散在分布,缺血側(cè)可見大量黃棕色陽性細(xì)胞,以圓形為主。假手術(shù)組凋亡細(xì)胞數(shù)(10±1)%,替勃龍組(11±1)%,模型組(28±2)%,與模型組比較替勃龍組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異有顯著性(P<0.01)。見圖1。圖1 各組缺血側(cè)皮層TUNEL染色(×400)
2.3 Bcl2在同側(cè)皮層表達(dá)的百分率
在腦組織切片中,Bcl2陽性表達(dá)表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色深染。假手術(shù)組陽性細(xì)胞數(shù)(32±2)%,替勃龍組陽性細(xì)胞數(shù)(33±2)%,模型組陽性細(xì)胞數(shù)(5±1)%,替勃龍組較模型組Bcl2陽性細(xì)胞增多(P<0.01)。
2.4 IL1β、TNFα在同側(cè)皮層表達(dá)的百分率
在腦組織切片中,IL1β及TNFα陽性表達(dá)表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色深染。替勃龍組較模型組IL1β及TNFα表達(dá)減弱(P<0.01),見表2。表2 各組大鼠腦皮層IL1β、TNFα的表達(dá)
3 討 論
有研究證實外源性雌激素可以明顯降低實驗性MCAO大鼠的死亡率,減少腦梗死面積,證明外源性雌激素具有缺血性神經(jīng)保護(hù)作用〔3〕,然而外源性雌激素因增加乳腺及婦科腫瘤發(fā)病率而限制了臨床應(yīng)用。替勃龍是一種組織選擇性雌激素活性調(diào)節(jié)劑,它對身體的某些特殊部分產(chǎn)生雌激素活性。但是,它在子宮內(nèi)膜上不起雌激素的作用,不刺激子宮內(nèi)膜增殖,對乳腺無雌激素效應(yīng)。本實驗通過觀察替勃龍?zhí)娲委煂θヂ殉泊笫缶衷钚阅X缺血再灌注后炎癥因子及細(xì)胞凋亡指標(biāo)的變化,發(fā)現(xiàn)替勃龍治療組缺血/再灌注24 h,組織中IL1及TNF表達(dá)均較對照組減低,而凋亡拮抗因子Bcl2表達(dá)增強,神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)減少,并且腦梗死體積明顯縮小,具有保護(hù)神經(jīng)元的作用。與Chiappetta〔4〕,Won〔3〕等的研究結(jié)果一致。
腦缺血再灌注損傷是一系列復(fù)雜的病理過程,腦缺血后再灌注期間組織發(fā)生復(fù)雜的繼發(fā)性改變,加重組織損傷。再灌注后神經(jīng)元的死亡有壞死和凋亡2種方式,且兩者可以并存。炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中也發(fā)揮重要作用。腦缺血再灌注早期產(chǎn)生的IL1β、TNFα等炎性因子可激活白細(xì)胞(特別是多形核白細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞)黏附到腦缺血區(qū)微血管內(nèi)皮細(xì)胞上,引起內(nèi)皮細(xì)胞皺縮、破裂和壞死,破壞血腦脊液屏障,并可在細(xì)胞因子作用下遷移入腦組織,釋放各種細(xì)胞毒性物質(zhì)(如蛋白酶、磷脂酶、NO等)損傷腦組織,參與神經(jīng)元的損害。正常情況下IL1β與TNFα的表達(dá)水平非常低,但在腦缺血發(fā)生后可以被誘導(dǎo),表達(dá)迅速增加〔5〕。
細(xì)胞凋亡即細(xì)胞程序性死亡,是腦缺血后神經(jīng)元死亡的另一種重要形式,是由多個基因參與調(diào)控的非炎癥性死亡。據(jù)報道在MCAD栓塞所致的局灶性腦缺血后,用分子生物學(xué)方法增加腦內(nèi)的Bcl2的表達(dá),可減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。Bcl2蛋白是一種與細(xì)胞器,尤其是線粒體膜相關(guān)的穩(wěn)定蛋白,主要位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜,它可保護(hù)膜的穩(wěn)定性,減少細(xì)胞內(nèi)、核內(nèi)Ca2+濃度的改變,從而阻止凋亡信號的傳導(dǎo)。目前認(rèn)為Bcl2基因是一種重要的內(nèi)源性抗凋亡因子,缺血腦組織中Bcl2的表達(dá)是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。綜上所述,替勃龍可能通過抗炎及抗凋亡作用發(fā)揮其神經(jīng)元保護(hù)作用。
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2 田文艷,武紅利,鐘亞麗,等.利維愛對絕經(jīng)后婦女氧化低密度脂蛋白及內(nèi)皮功能的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2008;28(21):21112.
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4 Chiappetta O,Gliozzi M,Siviglia E,et al.Evidence to implicate early modulation of interleukin1beta ex[x]pression in the neuroprotection afforded by 17betaestradiol in male rats undergone transient middle cerebral artery occlusion〔J〕.Int Neurobiol,2007;82:35772.
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