替勃龍對去卵巢大鼠腦缺血再灌注保護(hù)作用

作者：田文艷,張洪義1,蘇立凱,申文增1　　作者單位：1 河北大學(xué) (河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000)

　　【摘要】目的研究替勃龍對缺血性腦損害的神經(jīng)保護(hù)作用及可能機制。方法 30只雌性成年SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組，模型組,替勃龍組;采用大鼠大腦中動脈閉塞制成局灶性腦缺血模型。在缺血2 h、再灌注24 h后立即斷頭取腦,應(yīng)用TTC染色觀察腦梗死體積，TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞數(shù)，免疫組化法檢測Bcl2以及白介素(IL)1β和腫瘤壞死因子(TNF)α的表達(dá)，并進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。結(jié)果 替勃龍組較模型組腦梗死體積顯著縮小(P<0.05);TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)少(P<0.01);Bcl2陽性細(xì)胞增多(P<0.01);IL1β及TNFα表達(dá)減弱，差異有顯著性(P<0.01)。結(jié)論 替勃龍可減輕去卵巢大鼠腦缺血再灌注損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　【關(guān)鍵詞】 替勃龍;腦缺血;凋亡;IL1β;TNFα
　　【Abstract】 ob[x]jective To study the neuroprotective effect of tibolone and the possible roles during cerebral ischemia injury.Methods 30 healthy adult female Sprague Dawley rats were selected, and randomly divided into shamoperated, ovariectomized, tibolone (2.5 mg·d-1·kg-1) groups.Brain ischemia model was induced by left middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 2 hours, at 24 hours after reperfusion.All animals were killed.Cerebral infarction volume was determined by 2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride (TTC) staining and image analysis.Apoptotic cells were labeled by terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL) .The ex[x]pression of Bcl2 /IL1β/TNFα was analyzed by immunohistochemical method.The changes of tissue pathology were also investigated.Results Cerebral infarction volumes were reduced significantly in tibolone treated groups than thos in ovariectomized group (P<0.05).Tibolone decreased the ex[x]pression of TUNEL (P<0.01), and increased the ex[x]pression of bcl2 (P<0.01).The protein ex[x]pression of IL1β and TNFα in tibolone group decreased obviously compared with those in ovariectomized group (P<0.01).Conclusions Tibolone decreases the injury following cerebral ischemiareperfusion in OVX rats and have neuroprotective effect.

　　【Key words】 Tibolone; Cerebrovascular Disorders; Apoptosis; IL1β; TNFα
　　據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究表明，雌激素替代治療能使絕經(jīng)期婦女腦梗死的相對危險度及與相關(guān)死亡率下降〔1〕。替勃龍(tibolone,7甲基異炔諾酮)為一種組織特異性的甾體類固醇，對骨及陰道組織產(chǎn)生雌激素樣作用,但不刺激子宮內(nèi)膜和乳腺組織，不僅能改善更年期癥狀,還可能在老年女性心腦血管疾病預(yù)防及治療方面發(fā)揮有利作用〔2〕。本文旨在探討替勃龍對去卵巢大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷保護(hù)作用及可能機制，為臨床絕經(jīng)后婦女合理應(yīng)用雌激素替代治療提供更多理論依據(jù)。
　　1 材料與方法
　　1.1 實驗動物

　　5月齡健康雌性SD大鼠30只，體重250～270 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(動物使用許可證號SCXK20031003)。
　　1.1.1 實驗動物分組

　　按體重隨機分為3組：假手術(shù)組、模型組、替勃龍組，各組10只。假手術(shù)組行下腹切開,見到雙側(cè)卵巢,但不切除任何組織;其余兩組于腦缺血術(shù)前14 d切除雙側(cè)卵巢。替勃龍組，替勃龍(荷蘭歐加農(nóng)生產(chǎn),南京歐加農(nóng)制藥分裝)0.25 mg·kg-1·d-1灌胃;假手術(shù)組和模型組每日同等量蒸餾水灌胃。實驗期間所有動物置于同一室內(nèi),二級環(huán)境分籠飼養(yǎng),自由飲水,室溫(21±4)℃,光照12 h,黑暗12 h。
　　1.1.2 腦缺血再灌注模型制作
　　用改良Longa法制作大鼠大腦中動脈阻斷(MCAO)模型。以10%水合氯醛麻醉后，暴露并鈍性游離左側(cè)頸總動脈(CCA),結(jié)扎同側(cè)CCA近心端和頸外動脈(ECA)分叉部,距CCA末端約5 mm處剪口,用直徑0.24 mm的日本尼龍線沿頸內(nèi)動脈(ICA)方向插入,深度由分叉部算約 (18.5±0.5)mm,于ICA近心端結(jié)扎該動脈,全層縫合切口,再灌注時抽出尼龍線10 mm。以動物清醒后爬行時向右轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象),嚴(yán)重時向右跌倒,提尾時右前肢內(nèi)收屈曲,為入選標(biāo)準(zhǔn)。于腦缺血手術(shù)2 h后再灌注，24 h后斷頭取腦。
　　1.2 指標(biāo)檢測及方法

　　1.2.1 腦梗死體積測定
　　大鼠腦缺血2 h,再灌注24 h后斷頭取腦。取左側(cè)大腦半球，冠狀面均勻切成2 mm 厚腦片，染色固定，照相測量并計算出總的梗死體積。用計算機多媒體彩色圖像分析系統(tǒng)測量腦梗死體積。
　　1.2.2 免疫組化及細(xì)胞凋亡的檢測
　　大鼠腦缺血2 h,再灌注24 h后斷頭取腦,距額極3～5 mm冠狀切取材,放入4%多聚甲醛固定24 h后,制成石蠟切片,用于免疫組織化學(xué)染色。SP法檢測抗凋亡基因Bcl2的表達(dá)以及白細(xì)胞介素1β(IL1β)和腫瘤壞死因子α(TNFα)的表達(dá)。采用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics 公司ImagePro Plus)。在光鏡下圖像分析,每張切片采集缺血周邊區(qū)具有代表性10個高倍視野,計算平均數(shù)。采用缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法原位標(biāo)記DNA片段檢測凋亡細(xì)胞。具體步驟參照產(chǎn)品說明書。
　　1.3 統(tǒng)計學(xué)方法
　　應(yīng)用SPSS10.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示,多組間比較進(jìn)行方差分析及兩兩比較q檢驗。
　　2 結(jié) 果
　　2.1 梗死體積

　　兩組梗死體積差異顯著(P<0.05)。見表1。表1 替勃龍對腦缺血模型大鼠梗死體積的影響
　　2.2 細(xì)胞凋亡

　　模型組對側(cè)僅見數(shù)個陽性細(xì)胞散在分布,缺血側(cè)可見大量黃棕色陽性細(xì)胞,以圓形為主。假手術(shù)組凋亡細(xì)胞數(shù)(10±1)%，替勃龍組(11±1)%，模型組(28±2)%，與模型組比較替勃龍組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異有顯著性(P<0.01)。見圖1。圖1 各組缺血側(cè)皮層TUNEL染色(×400)

　　2.3 Bcl2在同側(cè)皮層表達(dá)的百分率
　　在腦組織切片中,Bcl2陽性表達(dá)表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色深染。假手術(shù)組陽性細(xì)胞數(shù)(32±2)%，替勃龍組陽性細(xì)胞數(shù)(33±2)%，模型組陽性細(xì)胞數(shù)(5±1)%，替勃龍組較模型組Bcl2陽性細(xì)胞增多(P<0.01)。
　　2.4 IL1β、TNFα在同側(cè)皮層表達(dá)的百分率

　　在腦組織切片中，IL1β及TNFα陽性表達(dá)表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色深染。替勃龍組較模型組IL1β及TNFα表達(dá)減弱(P<0.01),見表2。表2 各組大鼠腦皮層IL1β、TNFα的表達(dá)

　　3 討 論
　　有研究證實外源性雌激素可以明顯降低實驗性MCAO大鼠的死亡率,減少腦梗死面積,證明外源性雌激素具有缺血性神經(jīng)保護(hù)作用〔3〕，然而外源性雌激素因增加乳腺及婦科腫瘤發(fā)病率而限制了臨床應(yīng)用。替勃龍是一種組織選擇性雌激素活性調(diào)節(jié)劑,它對身體的某些特殊部分產(chǎn)生雌激素活性。但是,它在子宮內(nèi)膜上不起雌激素的作用，不刺激子宮內(nèi)膜增殖,對乳腺無雌激素效應(yīng)。本實驗通過觀察替勃龍?zhí)娲委煂θヂ殉泊笫缶衷钚阅X缺血再灌注后炎癥因子及細(xì)胞凋亡指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)替勃龍治療組缺血/再灌注24 h，組織中IL1及TNF表達(dá)均較對照組減低，而凋亡拮抗因子Bcl2表達(dá)增強，神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)減少，并且腦梗死體積明顯縮小，具有保護(hù)神經(jīng)元的作用。與Chiappetta〔4〕，Won〔3〕等的研究結(jié)果一致。
　　腦缺血再灌注損傷是一系列復(fù)雜的病理過程，腦缺血后再灌注期間組織發(fā)生復(fù)雜的繼發(fā)性改變,加重組織損傷。再灌注后神經(jīng)元的死亡有壞死和凋亡2種方式,且兩者可以并存。炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中也發(fā)揮重要作用。腦缺血再灌注早期產(chǎn)生的IL1β、TNFα等炎性因子可激活白細(xì)胞(特別是多形核白細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞)黏附到腦缺血區(qū)微血管內(nèi)皮細(xì)胞上,引起內(nèi)皮細(xì)胞皺縮、破裂和壞死,破壞血腦脊液屏障,并可在細(xì)胞因子作用下遷移入腦組織，釋放各種細(xì)胞毒性物質(zhì)(如蛋白酶、磷脂酶、NO等)損傷腦組織，參與神經(jīng)元的損害。正常情況下IL1β與TNFα的表達(dá)水平非常低，但在腦缺血發(fā)生后可以被誘導(dǎo)，表達(dá)迅速增加〔5〕。
　　細(xì)胞凋亡即細(xì)胞程序性死亡，是腦缺血后神經(jīng)元死亡的另一種重要形式，是由多個基因參與調(diào)控的非炎癥性死亡。據(jù)報道在MCAD栓塞所致的局灶性腦缺血后,用分子生物學(xué)方法增加腦內(nèi)的Bcl2的表達(dá),可減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。Bcl2蛋白是一種與細(xì)胞器,尤其是線粒體膜相關(guān)的穩(wěn)定蛋白,主要位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜,它可保護(hù)膜的穩(wěn)定性,減少細(xì)胞內(nèi)、核內(nèi)Ca2+濃度的改變,從而阻止凋亡信號的傳導(dǎo)。目前認(rèn)為Bcl2基因是一種重要的內(nèi)源性抗凋亡因子,缺血腦組織中Bcl2的表達(dá)是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。綜上所述,替勃龍可能通過抗炎及抗凋亡作用發(fā)揮其神經(jīng)元保護(hù)作用。
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