干擾素-γ+874位點(diǎn)基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的關(guān)系

    作者：劉佳,韓麗莎,秦文斌　　作者單位：包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060
    The Correlation between Genetic Polymorphism of Interferon-gamma +874 and

　　Susceptibility to Chronic Obstructive Pulmonary Disease

　　LIU Jia, HAN Lisha, QIN Wenbin

　　(Baotou Medical College, Baotou 014060, China)

　　Abstract　ob[x]jective: To explore the frequency distribution of genetic polymorphism of interferon-γ+874(IFN-γ+874) in the patients with chronic obstructive pulmonary diseases(COPD) among Han nationality in Inner Mongolia and to analyze the correlation between genetic polymorphism of IFN-γ+874 and the incidence of COPD. Methods: The case-control method was employed to carry out a questionnaire investigation of the related data and genotype and allele frequency of IFN-γ+874 in the COPD group and the control group was determined with PCR-SSP. Results: The genotype frequency of IFN-γ+874 AA, AT and TT was 82.8 %, 17.2 % and 0.0 %, respectively, in COPD group and that in the control group was 63.4 %, 33.3 % and 3.1 %, respectively. Allele frequency of IFN-γ+874A and T was 91.4 % and 8.6 % in COPD group, and that in the control group was 80.3 % and 19.7 %. Genotype frequency of IFN-γ+874AA and allele frequency of IFN-γ+874A in COPD were both higher than those in the control group(P<0.05). Conclusion: Genetic polymorphism of IFN-γ+874 is correlated to the incidence of COPD among the population of Han nationality in Inner Mongolia.

　　Key words　COPD; The interferon gamma; Polymorphism genetics

　　慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive pulmonary disease,COPD)是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，以慢性氣流阻塞、進(jìn)行性發(fā)展為特征，嚴(yán)重危害人類健康，降低生活質(zhì)量。發(fā)病與環(huán)境和遺傳因素有關(guān)，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。

　　干擾素gamma(IFN-γ)內(nèi)含子區(qū)+874位點(diǎn)A/T單核苷酸多態(tài)性影響轉(zhuǎn)錄及IFN-γ的表達(dá)量[1-2]。而IFN-γ+874位點(diǎn)基因多態(tài)性是否與COPD發(fā)病有關(guān)，到目前為止尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用病例對照方法分析探討IFN-γ基因多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)COPD患者發(fā)病的關(guān)系，為深入研究COPD的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

　　1　材料與方法

　　1.1　研究對象　COPD組64例，按照2003年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會COPD診療指南[3]綜合分析確定，病例由包頭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院、包頭市中心醫(yī)院、鄂爾多斯市中心醫(yī)院提供。對照組66例為健康體檢者，未患呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病，由包頭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。COPD組與對照組靜脈采血2.0 mL，以枸櫞酸鈉抗凝，-20 ℃冰箱中保存。研究對象的一般資料見表1。表1　研究對象的一般情況計(jì)量資料以x±s表示，F(xiàn)EV1:秒用力呼氣容積，F(xiàn)VC:用力呼氣肺活量

　　1.2　試劑與儀器　試劑購自北京鼎國生物工程公司，引物由上海生工生物工程公司合成。PCR儀(The Perkin-Elmer Corporation PE480),紫外透射反射分析儀(上海康禾光電儀器有限公司)，DYCZ-24D型垂直電泳槽(北京六一儀器廠)。

　　1.3　方法

　　1.3.1　DNA提取　枸櫞酸鈉抗凝的凍存血，室溫放置自然融化后取50 μL到1.5 mL的EP管中，加雙蒸水至1 mL，混勻，室溫靜置15 min后3 000 rmp離心1 min，棄上清留殘液;向1.5 mL的EP管中加裂解液60 μL，震蕩器上劇烈震蕩100 s;沸水煮10 min，流水冷卻約50 s，振蕩器再次劇烈震蕩約100 s;11 500 rmp高速離心4 min，上清液中含有模板DNA。

　　1.3.2　引物　上海生工生物工程公司合成。正向引物P1序列：5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCA-3'，正向引物P2序列：5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCT-3'，外參正向引物P3序列：5'-GCCTTCCAACCATTCCCTTA-3'，反向引物p4序列：5'-TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3'。

　　1.3.3　PCR及IFN-γ+874 SNP鑒定　聯(lián)合聚合酶鏈反應(yīng)順序特異性引物法(PCR-SSP)對IFN-γ的基因進(jìn)行檢測。每個(gè)樣本設(shè)立3個(gè)反應(yīng)管，分別加有特異引物P1、P2、P3。PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體積為12.5 μL，包括：10×PCR buffer 1.25 μL，4×dNTP 0.25 μL，DNA模板2 μL，Taq DNA聚和酶(2 U/μL)0.5 μL，上下游引物各0.1 μL,滅菌雙蒸水加至12.5 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，2 min;變性94 ℃，25 s;退火60 ℃，35 s;延伸72 ℃，45 s;10個(gè)循環(huán)后，變性94 ℃，25 s;退火56 ℃，35 s;延伸72 ℃，45 s;20個(gè)循環(huán)，總延伸72 ℃，5 min。每次檢測至少設(shè)置2個(gè)空白對照，PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

　　1.3.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　采用SPSS 15.0建立數(shù)據(jù)庫，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

　　2　結(jié)果

　　2.1　PCR擴(kuò)增　特異引物P1擴(kuò)增出的IFN-γ基因AA產(chǎn)物和P2擴(kuò)增出的IFN-γ基因AT產(chǎn)物均為261 bp,內(nèi)參引物P4擴(kuò)增產(chǎn)物為426 bp，每例樣本有3管擴(kuò)增產(chǎn)物，即A、T、外參，見圖1。

　　圖1　IFN-γ+874位點(diǎn)基因PCR擴(kuò)增

　　第1、4、8泳道為T;第2、5、9泳道為A;第3、6、10泳道為外參，第7泳道為Marker。樣本1為AT雜合子(1、2、3泳道)，樣本2為TT純和子(4、5、6泳道)，樣本3為AA純和子(8、9、10泳道)。

　　2.2　IFN-γ+874基因型頻率及等位基因頻率的比較　COPD組IFN-γ+874位點(diǎn)AA、AT、TT基因型的頻率分別為82.8 %、17.2 %和0.0 %，正常對照組AA、AT、TT基因型的頻率分別為63.6 %、33.3 %、3.1 %，COPD組AA基因型頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.073，P=0.013);COPD組IFN-γ+874位點(diǎn)A、T等位基因頻率分別為91.4 %、8.6 %，對照組中為80.3 %、19.7 %，COPD組A等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.356,P=0.021)。見表2。表2　COPD組與對照組中IFN-γ基因型頻率與等位基因頻率比較

　　3　討論

　　COPD發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，而以細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主的氣道壁及肺泡隔的慢性炎癥和進(jìn)行性發(fā)展的氣道阻塞是COPD發(fā)病的兩大特點(diǎn)[4-5]。由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ有可能是連接COPD發(fā)病機(jī)制中細(xì)胞分子生物學(xué)和蛋白酶/抗蛋白酶系統(tǒng)失衡的橋梁[6]。

　　IFN-γ為一種低分子量的糖蛋白，是細(xì)胞因子的重要組成之一，產(chǎn)生于CD4+TH1和CD8+TC1細(xì)胞，可激活中性粒細(xì)胞，發(fā)生呼吸爆發(fā);也可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附及血管外滲出，參與人體炎癥和免疫反應(yīng)，是COPD發(fā)病過程中的重要細(xì)胞因子。IFN-γ的合成為遺傳基因所控制，IFN基因位于染色體12q13-q24。位于基因表達(dá)調(diào)控區(qū)序列的基因SNP在疾病的個(gè)體差異方面有重要意義。IFN-γ+874位點(diǎn)正好位于轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，此處出現(xiàn)SNP直接影響與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，從而影響IFN-γ的表達(dá)[7]，TT為高表達(dá)基因型,AA為低表達(dá)基型,AT為中等表達(dá)基因型。IFN-γ在成年鼠肺中的表達(dá)能導(dǎo)致許多方面類似人類COPD損害的表現(xiàn)[8]，由此可以推想，人類IFN-γ基因多態(tài)性可能與其COPD的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[9]。為明確IFN-γ基因多態(tài)性與COPD的發(fā)病的關(guān)系是否相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)對內(nèi)蒙古地區(qū)COPD患者IFN-γ基因多態(tài)性進(jìn)行檢測分析，研究結(jié)果顯示IFN-γ+874位點(diǎn)AA基因型頻率在COPD組高于對照組，A等位基因型頻率在COPD組亦高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IFN-γ+874位點(diǎn)基因多態(tài)性與COPD的發(fā)病有關(guān)，攜帶AA基因的個(gè)體患COPD的危險(xiǎn)性增加，其機(jī)制可能是由于干擾素-γ主要活性就是參與免疫調(diào)節(jié),在體內(nèi)起雙向調(diào)節(jié)作用：一方面,干擾素-γ可激活NK等細(xì)胞,參與炎癥反應(yīng);另一方面,它能抑制B細(xì)胞分泌IgE,抑制超敏反應(yīng)的發(fā)生。攜帶AA基因的個(gè)體干擾素-γ的合成或分泌不足，機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力降低，炎癥與抗炎作用失衡，導(dǎo)致了COPD的發(fā)生、發(fā)展。然而COPD是一種多因素參與的疾病，其中環(huán)境因素和遺傳因素均起著重要作用，其作用的具體機(jī)制仍有待深入研究。