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MRM3模式在多肽藥物生物分析中的應(yīng)用解決方案

文章來源：alemdaconsulta.com發(fā)布日期：2013-12-24瀏覽次數(shù)：22426

       隨著制藥企業(yè)對生物治療藥物的日益重視,在藥物研究中使用LCMS定量分析蛋白和多肽藥物已經(jīng)引起越來越多研究者的興趣。艾塞那肽是一種治療性多肽,目前已被批準(zhǔn)用于治療I型和II型糖尿病。艾塞那肽可增強(qiáng)胰腺β細(xì)胞分泌葡萄糖依賴性胰島素,以調(diào)節(jié)糖代謝和胰島素分泌。 近年來,血漿中艾塞那肽的濃度測定主要通過配體實(shí)驗(yàn)來完成,例如利用酶標(biāo)免疫測定法進(jìn)行艾塞那肽的 藥代動力學(xué)研究。但是,由于某些具有相似理化性質(zhì)的化合物的存在,致使酶標(biāo)免疫測定法缺乏足夠的特異 性和選擇性,導(dǎo)致采用該方法分析將面臨一定的風(fēng)險(xiǎn)?；谝陨显?采用AB SCIEX QTRAP® 5500系統(tǒng)的 MRM3模式確保分析血漿中多肽藥物時(shí)能夠達(dá)到更高的選擇性。 實(shí)驗(yàn)方法
       樣品制備:提取人血漿中的艾塞那肽,用氮?dú)?/a>吹干,復(fù)溶。在所有的操作步驟中,pH值及有機(jī)相都要嚴(yán)格控制。 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在藥物高通量篩選和生物分析中的應(yīng)用

       液相色譜條件:UHPLC采用Shimadzu UFLC LC-20ACXR;反相色譜柱為C-18 2.0 x30mm,5μ;流速為 0.6mL/min;進(jìn)樣體積為5 μL;流動相A為含0.1%甲酸的水溶液,流動相B為含0.1%甲酸的甲醇溶液;梯度5分 鐘,流動相B濃度從2%升至95%。 質(zhì)譜條件:使用AB SCIEX QTRAP® 5500系統(tǒng)中的MRM3掃描模式進(jìn)行LC/MS分析。開啟離子阱的動態(tài)填充時(shí)間(DFT)功能,在10,000Da/s的掃描速度下進(jìn)行MS3掃描。總周期時(shí)間為0.17s。采用質(zhì)荷比 838→396→202進(jìn)行MRM3分析。QTRAP® 5500系統(tǒng)進(jìn)行MRM3分析原理展示在圖2中。 

       圖1. 艾塞那肽結(jié)構(gòu)。艾塞那肽是由39個(gè)氨基酸組成的多肽(MW =4186.6 Da),是糖代謝和胰島素分泌的調(diào)節(jié)劑。 

       圖2. MRM3定量分析工作原理。首先在Q1四極桿中選擇母離子,然后在Q2碰撞池中碎裂,其子離子在線性離子阱中富集并分離,接著通過激發(fā)產(chǎn)生第二級碎片,然后將第二級產(chǎn)物離子掃描至檢測器。 
       實(shí)驗(yàn)結(jié)果
       在增強(qiáng)全掃描模式(EMS)下,選擇多電荷母離子[M+5H]5+838.3作為前體離子(母離子,圖3,上左 圖)。當(dāng)前體離子碎裂后,選擇m/z 396.4為級子離子(增強(qiáng)子離子掃描(EPI),圖3,上右圖)。 級子離子m/z 396.4在阱內(nèi)進(jìn)一步碎裂產(chǎn)生MS3質(zhì)譜(圖3,下圖),選擇其中主要的碎片離子m/z 202.2作為 MS3定量的第二級子離子。 艾塞那肽檢測結(jié)果 使用MRM3方法后,顯著提高了人血漿中艾塞那肽分析方法的選擇性。圖4展示出了MRM3方法與傳統(tǒng)的 MRM定量方法所得結(jié)果的對比,MRM3方法結(jié)果中基線更低,完全消除了血漿中的內(nèi)源性干擾。QTRAP® 5500 快速的掃描速度(10,000Da/s)可使分析物的色譜峰有足夠的采集點(diǎn),從而使定量結(jié)果具有很好的重現(xiàn)性。 如表1中所示,MRM3方法顯著改善LLOQ及QC的分析結(jié)果,6次連續(xù)進(jìn)樣分析的準(zhǔn)確度及CV%證明: MRM3方法具有很好的定量性能,完全適用于生物分析。
 

       圖3. MRM3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。 EMS掃描(上左圖)后選擇豐度高的母離子,然后使用EPI掃描以識別出強(qiáng)的碎片離子(上右圖),后采用MS3掃描選擇佳第二級碎片進(jìn)行提取。 

       圖4. MRM3檢測方法顯著提高血漿中化合物檢測的選擇性。 進(jìn)行血漿中艾塞那肽檢測時(shí),MRM3模式可通過消除色譜干擾、降低背景噪音來改善LOQ。
結(jié)論
       更好的線性(R2=0.996)。 表1:MRM3方法檢測的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。質(zhì)量控制樣品的重復(fù)性結(jié)果表明: MRM3分析與驗(yàn)證的生物分析相一致。 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在藥物高通量篩選和生物分析中的應(yīng)用

       圖5. 使用MRM和MRM3方法檢測人血漿中艾塞那肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 MRM3(右圖)的線性范圍是5-1000ng/mL,相對MRM(左圖)的250-1000ng/mL,MRM3方法明顯具有更好的線性(R2=0.996)。 

       表1:MRM3方法檢測的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。質(zhì)量控制樣品的重復(fù)性結(jié)果表明: MRM3分析與驗(yàn)證的生物分析相一致。 
       結(jié)論
       1. MRM3分析方法可以成功應(yīng)用于人血漿中艾塞那肽生物分析。 
       2. MRM3分析能夠提高生物分析方法的選擇性,消除基線噪音及色譜干擾,與傳統(tǒng)的艾塞那肽MRM分析結(jié)果相比體現(xiàn)了卓越的分析性能。 
       3. MRM3分析結(jié)果顯示其可獲得從5-2000ng/mL濃度范圍內(nèi)優(yōu)異的標(biāo)準(zhǔn)線性。相比較,傳統(tǒng)的MRM方法的 線性濃度范圍為250-1000ng/mL。
       4. MRM3方法檢測的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性完全符合生物分析實(shí)驗(yàn)的要求。