刺參黏多糖對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞caspase表達(dá)影響

    作者：王穎　　作者單位：青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島

　　【摘要】 目的 探討刺參黏多糖對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞株體外生長(zhǎng)、凋亡的影響及可能機(jī)制。方法 以0～8.0 g/L刺參黏多糖分別處理Hela細(xì)胞24～120 h后，以四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)活性，透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，RTPCR法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因caspase3、caspase9 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 刺參黏多糖對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，電鏡下可觀察到凋亡小體等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。隨著藥物濃度及作用時(shí)間的增加，caspase3及casepase9 mRNA表達(dá)增加。結(jié)論 刺參黏多糖可抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)誘導(dǎo)caspase3及caspase9 mRNA表達(dá)增多實(shí)現(xiàn)的。

　　【關(guān)鍵詞】 刺參科 宮頸腫瘤 Hela細(xì)胞 凋亡 caspase

　　EFFECT OF STICHOPUS JAPONICUS SEKENKA ON CASPASE ex[x]pression OF HELA CELLS OF CERVIX NEOPLASMS　　WANG YING, YU ZHUANG, SONG YANG　　Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China　　[ABSTRACT] ob[x]jective To study the apoptosis of Hela cells of cervix neoplasms induced by stichopus japonicus sekenka (SJAMP) and its possible mechanism. Methods Hela cells were treated with different doses of SJAMP on different time. The inhibitory effect on cell proliferation was assayed by MTT, the apoptosis observed by electronic microscopy. The ex[x]pression of caspase3 and caspase9 was assayed with reverse transc[x]riptionpolymerase chain reaction (RTPCR). Results SJAMP suppressed the growth of Hela cells obviously in doseand timedependent manners. Morphological changes of cell apoptosis, such as karyopyknosis and conglomeratio, were observed electronic microscopically. RTPCR assay showed the ex[x]pression of caspase3 and caspase9 increased after exposure to different doses of SJAMP on different time. Conclusion SJAMP can inhibit proliferation and induce apoptosis of Hela cells, caspase3 and caspase9 may have an important rule in the regulation of cell apoptosis.

　　[KEY WORDS] Stichipodidae; Cervix neoplasms; Hela cells; Apoptosis; Caspase

　　刺參黏多糖(SJAMP)為海洋腔腸類動(dòng)物刺參體內(nèi)提取的一種天然海洋活性物質(zhì)，屬多糖類物質(zhì)。初步研究證實(shí)，SJAMP具有廣譜的抗腫瘤活性，能抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖，但有關(guān)其與凋亡的關(guān)系的研究則少見(jiàn)報(bào)道。本研究以SJAMP作用于人宮頸癌Hela細(xì)胞，觀察其誘導(dǎo)凋亡的作用，并進(jìn)一步探討其可能機(jī)制。

　　1 材料和方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　SJAMP，由中國(guó)海洋大學(xué)藥物研究所提供，相對(duì)分子質(zhì)量 122 248，純度 99.5%; DMEM、胰蛋白酶， GIBCO公司產(chǎn)品;胎牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品;TRIzol試劑，GIBCO公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega公司產(chǎn)品;TaqDNA聚合酶，上海中科開(kāi)瑞生物芯片科技股份有限公司產(chǎn)品。BNP310恒溫CO2培養(yǎng)箱，日本TABAI ESOEC公司;PCR儀，Biometra公司;ViDAS21圖像分析系統(tǒng)，德國(guó)歐波同公司;天能凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技公司;流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

　　人宮頸癌Hela細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室傳代保存，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2、37 ℃濕化孵箱中。培養(yǎng)基DMEM含體積分?jǐn)?shù)0.10的FBS，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞待用。

　　1.2.2 MTT法檢測(cè)SJAMP對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

　　調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×107 /L,將200 μL細(xì)胞接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;分組加藥，以未加藥組為對(duì)照組，調(diào)整藥物濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L(各組取6個(gè)復(fù)孔)，培養(yǎng)72 h，每孔加入20 μL MTT液(5 g/L)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后吸取上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，測(cè)波長(zhǎng)570 nm 處吸光度(A) 值，計(jì)算SJAMP對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率。抑制率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值) / 對(duì)照組A值×。

　　1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

　　選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，常規(guī)消化后，置37 ℃，含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2 濕化培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h，隨機(jī)分為空白對(duì)照組和給藥組，給藥組分別加入0.8、1.2、1.6 g/L SJAMP，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液，分別于給藥后24、72和120 h在倒置顯微鏡下觀察各組Hela細(xì)胞的形態(tài)改變。細(xì)胞常規(guī)消化離心后，經(jīng)固定、脫水、包埋、固化、染色、切片等處理，透射電鏡(JEOL公司JEM1200EX)觀察。

　　1.2.4 凋亡相關(guān)基因caspase3、caspase9表達(dá)檢測(cè)

　　采用RTPCR法。以βactin作為內(nèi)參照，目的基因片段為caspase3和 caspase9。內(nèi)參引物均由DNAStar軟件設(shè)計(jì)，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。見(jiàn)表1。表1 目的基因及其內(nèi)參引物基因上游引物 (略)

　　以對(duì)照組(不加藥)及3種藥物濃度(0.8、1.2、

　　1.6 g/L)處理后24、72、120 h的Hela細(xì)胞為樣本，按照TRIzol試劑說(shuō)明書分別提取RNA。RTPCR反應(yīng)條件：混勻后42 ℃ 1 h，99 ℃加熱5 min，然后快速冷卻到4 ℃。反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA用作PCR反應(yīng)的模板，-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件：①caspase3: 94 ℃ 5 min預(yù)變性; 94 ℃45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min; 4 ℃保存。②caspase9: 94 ℃ 5 min預(yù)變性; 94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min; 4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳， 紫外線透射儀中觀察，拍照，并輸入天能凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。以目的PCR產(chǎn)物的吸光度(A)與內(nèi)參照PCR產(chǎn)物吸光度(A)的比值，作為半定量RTPCR結(jié)果。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件,結(jié)果以±s表示,兩組間比較用t檢驗(yàn),多組間數(shù)據(jù)比較用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

　　光鏡下觀察：對(duì)照組Hela細(xì)胞為多角形或梭形，貼壁牢固。經(jīng)SJAMP處理的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞逐漸變圓，細(xì)胞體積縮小，胞漿凝縮，折光率增強(qiáng)，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)懸浮細(xì)胞逐漸增多，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的特征性改變。

　　電鏡下觀察：在細(xì)胞凋亡的早期發(fā)生核內(nèi)染色質(zhì)聚集成塊，位于核膜下，形成“新月形”改變，到中期時(shí)細(xì)胞膜皺縮，形成小泡或突起，核膜破裂，塊狀染色質(zhì)散布于細(xì)胞中，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞形成許多由細(xì)胞膜包裹呈塊樣染色質(zhì)的小體，內(nèi)含正常的細(xì)胞器，即凋亡小體。

　　2.2 SJAMP對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

　　與對(duì)照組比較，各濃度SJAMP組A值均降低，隨著濃度的增高，A值降低愈明顯，差異有顯著性(F=658.20，q=3.06～45.32，P<0.05、0.01)。隨著SJAMP劑量的加大，細(xì)胞數(shù)量減少，A值相應(yīng)減小(q=3.91～42.27，P<0.01)，抑制率增大，呈明顯的劑量依賴關(guān)系，至8.0 g/L時(shí)細(xì)胞基本上全部被殺死。見(jiàn)表2。表2 不同濃度SJAMP作用下細(xì)胞吸光度(A)值及抑制率比較組別 A值(±s)抑制率(略)

　　2.3 SJAMP作用下Hela細(xì)胞caspase3及caspae9的表達(dá)

　　隨SJAMP濃度的增大及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Hela細(xì)胞中caspase3及caspase9的表達(dá)均有增加趨勢(shì)(圖2～5)。

　　3 討 論

　　細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過(guò)程，它的發(fā)生受

　　到機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控。許多抗癌藥物都是通過(guò)觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡通路而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的,因此，以藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也被用于新的抗腫瘤藥物的篩選。

　　SJAMP具有廣譜的抗腫瘤活性，能抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，但其抗腫瘤的分子機(jī)制還處于研究階段[1]。樊繪曾等[2]實(shí)驗(yàn)表明,小鼠經(jīng)腹腔或靜脈注射海參提取物對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤有顯著的抑制作用,特別是對(duì)MA737乳癌抑制率可達(dá)88%,對(duì)小鼠淋巴內(nèi)瘤S180抑制率為55%～61%,對(duì)小鼠淋巴內(nèi)瘤Lio21 和S37 的抑制率達(dá)66%,并可抑制肺癌轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。王振立等[3]通過(guò)3H2TdR 摻入試驗(yàn)研究顯示，SJAMP可明顯抑制S180 及鼠乳腺腫瘤細(xì)胞DNA 的合成,從而抑制腫瘤生長(zhǎng),而對(duì)荷瘤小鼠正常肝細(xì)胞的DNA 合成則能明顯促進(jìn),這有利于正常肝細(xì)胞的增殖。胡人杰等[4,5]研究了SJAMP與潑尼松聯(lián)合應(yīng)用對(duì)小鼠實(shí)體瘤的抑制作用,結(jié)果表明，SJAMP不僅可以恢復(fù)潑尼松所致的免疫抑制,而且對(duì)小鼠實(shí)體瘤、肺癌及胃纖維肉瘤均有較好的抑制作用,抑瘤率為27%～82%。

　　細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化是判斷凋亡發(fā)生可靠的標(biāo)準(zhǔn)[6]。細(xì)胞在發(fā)生凋亡過(guò)程中有著典型的形態(tài)學(xué)特征。本實(shí)驗(yàn)以不同劑量SJAMP作用于Hela細(xì)胞，觀察到了典型的凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變：在細(xì)胞凋亡的早期發(fā)生核內(nèi)染色質(zhì)聚集成塊，位于核膜下，形成“新月形”改變;到中期細(xì)胞膜皺縮，形成小泡或突起，核膜破裂，塊狀染色質(zhì)散布于細(xì)胞中，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞形成許多由細(xì)胞膜包裹呈塊樣染色質(zhì)的小體，內(nèi)含正常的細(xì)胞器，即凋亡小體。上述變化提示SJAMP可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

　　細(xì)胞凋亡可由外源性途徑(死亡受體途徑)和內(nèi)源性途徑(線粒體細(xì)胞色素C 途徑)所介導(dǎo)。外源性途徑由死亡誘導(dǎo)配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合后激活。死亡受體包括FAS、TNFR、TRAILR等, 受體與配體結(jié)合后發(fā)生寡聚化, 募集接頭蛋白FADD和caspase8形成DISC,caspase8自身切割活化, 進(jìn)一步激活下游的caspase(包括caspase3、caspase6、caspase7),啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。內(nèi)源性途徑由包括通過(guò)理化因素導(dǎo)致細(xì)胞的DNA損傷、生長(zhǎng)因子缺乏、氧化應(yīng)激等刺激信號(hào)激活。內(nèi)源性刺激導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放入胞漿，與凋亡酶激活因子1和caspase9 結(jié)合形成凋亡體, caspase9 自我剪切活化, 啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[7～11]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)凋亡的執(zhí)行者caspase3 以及其上游的主要激活因子caspase9 mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果顯示，經(jīng)藥物處理組Hela 細(xì)胞的caspase3和caspase9基因表達(dá)上調(diào),提示這些凋亡通路關(guān)鍵酶的激活可能是SJAMP誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的重要原因。并進(jìn)一步推測(cè)SJAMP誘導(dǎo)Hela 細(xì)胞凋亡和線粒體細(xì)胞色素C途徑參與有關(guān)。

　　綜上所述,本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制情況和caspase3、caspase9表達(dá)等方面證實(shí)，一定濃度的SJAMP在體外能夠誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞株Hela發(fā)生凋亡,并初步提示SJAMP誘導(dǎo)Hela 細(xì)胞凋亡和線粒體細(xì)胞色素C途徑參與有關(guān)。本文結(jié)果為SJAMP應(yīng)用于臨床腫瘤治療提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù), SJAMP有望成為具有良好應(yīng)用前景的抗癌藥物。