外源性人aFGF在內(nèi)皮祖細(xì)胞中的分泌

【關(guān)鍵詞】  酸性成纖維細(xì)胞生長因子;,信號肽;,轉(zhuǎn)基因

　　[摘 要]  目的: 觀察外源重組分泌型人酸性成纖維細(xì)胞生長因子（spaFGF）在內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）中的分泌。方法: 以腺相關(guān)病毒為載體, 將spaFGF基因和綠色熒光蛋白基因（GFP）分別導(dǎo)入內(nèi)皮祖細(xì)胞中。收集轉(zhuǎn)基因EPC和未轉(zhuǎn)基因EPC培養(yǎng)液, 用ELISA方法檢測其中的aFGF蛋白, 并比較3組細(xì)胞分泌的aFGF的量。結(jié)果: 在感染細(xì)胞的第4天, 轉(zhuǎn)基因EPC出現(xiàn)綠色熒光。spaFGFEPC組分泌的aFGF量顯著高于GFPEPC和EPC組[（862±49） ng/L vs （115±16） ng/L, P<005; （862±49） ng/L vs （98±10） ng/L, P<005）]。結(jié)論: 在EPC中導(dǎo)入外源性spaFGF基因能增強(qiáng)人aFGF的分泌。

　　[關(guān)鍵詞]  酸性成纖維細(xì)胞生長因子; 信號肽; 轉(zhuǎn)基因
   
　　通過基因修飾的方法促進(jìn)治療性血管新生是近年來心血管領(lǐng)域的一個新的研究熱點, 代表著一種克服缺血組織再灌注障礙和促進(jìn)側(cè)枝發(fā)展的新方向[1]。酸性成纖維細(xì)胞生長因子（acidic fibroblast growth factor, aFGF, FGF1）是FGF家族的重要成員, 在血管形成過程中有重要作用[2], 可以通過促進(jìn)受損內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)等機(jī)制, 促進(jìn)血管再生。由于原始aFGF缺乏信號肽, 不能由完整細(xì)胞分泌, 故直接用aFGF進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染, 治療效果不理想。本實驗中, 我們將一個帶有信號肽序列的重組人aFGF基因（spaFGF）克隆到AAV載體中, 以病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方式, 將spaFGF基因?qū)隕PC中。通過基因表達(dá), aFGF得以由EPC分泌, 為下一步研究轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植促進(jìn)缺血組織的血管新生奠定基礎(chǔ)。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  spaFGFpAAVIREShrGFP質(zhì)粒為本實驗室構(gòu)建; pAAVIREShrGFP質(zhì)粒、 pAAVRC質(zhì)粒和pHelper質(zhì)粒購自Stratagene公司; AAV293細(xì)胞, AAVHT1080細(xì)胞由發(fā)育生物學(xué)實驗室惠贈; EPC為本實驗室自備; 高糖DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶EDTA購自Gibco公司; aFGF ELISA試劑盒購自武漢博士德公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  構(gòu)建含外源基因的重組AAV  我們先前已構(gòu)建含信號序列的分泌型人aFGF基因[3], 并將此重組基因插入到AAV載體質(zhì)粒pAAVIREShrGFP上。攜帶spaFGF的重組pAAVIREShGrFP質(zhì)粒與pHelper質(zhì)粒、 pAAVRC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV293細(xì)胞后, 可包裝出編碼spaFGF基因的重組病毒spaFGFAAV; 用同樣的方法包裝出編碼綠色熒光蛋白的重組病毒GFPAAV。

　　1.2.2  AAV感染HT1080細(xì)胞  將AAVHT1080細(xì)胞以3×105/孔的密度接種在6孔板中, 每孔加入2 mL含100 mL/L FCS的DMEM培養(yǎng)液, 37℃、 50 mL/L CO2, 培養(yǎng)24 h。吸出6孔板中培養(yǎng)液, 按1 mL/孔將倍比稀釋的病毒液加到6孔板中, 細(xì)胞在37℃培養(yǎng)1 h后, 每孔加入1 mL含100 mL/L FCS的DMEM。繼續(xù)培養(yǎng)。

　　1.2.3  AAV感染內(nèi)皮祖細(xì)胞  將EPC分成3組, 按1×105個/孔接種到6孔板中。分別用AAVspaFGF和AAVhrGFP感染EPC, 未感染的EPC作為對照, 標(biāo)記為spaFGFEPC、 hrGFPEPC、 EPC。培養(yǎng)液為含50 mL/L胎牛血清的EGM2, 在37℃、 50 mL/L CO2中培養(yǎng)24 h。用PBS液洗滌細(xì)胞3次, 洗去血清成分。在試管中將200 μL AAV濃縮液與1 mL無血清的EBM2混合, 加入到每孔細(xì)胞中。分別標(biāo)記為“EPCspaFGF”, “EPChrGFP”和“EPC”。將細(xì)胞置于37℃、 50 mL/L CO2中培養(yǎng)2 h, 期間每隔15 min轉(zhuǎn)動1次培養(yǎng)板, 保證病毒液與細(xì)胞充分接觸。2 h后用1 mL含50 mL/L胎牛血清的EGM2代替無血清的EBM2, 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

　　1.2.4  檢測細(xì)胞分泌的aFGF蛋白  收集spaFGFEPC、 hrGFPEPC、 EPC 3組細(xì)胞培養(yǎng)液, 離心后, 取上清液, 用ELISA試劑盒檢測其中的人aFGF蛋白。取樣品與倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各01 mL加入已包被抗人aFGF抗體的酶標(biāo)板中, 一孔加樣品稀釋液作為0孔, 加蓋。37℃反應(yīng)120 min。反應(yīng)后甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體, 按01 mL/孔加入生物素抗人FGF acidic抗體工作液, 37℃反應(yīng)60 min。01 mol/L PBS洗滌后, 加入ABC工作液（TMB空白顯色孔除外）, 37℃反應(yīng)30 min。洗滌后加入TMB顯色液, 37℃避光反應(yīng)。30 min后加入TMB終止液測定A450值。

　　1.2.5  統(tǒng)計學(xué)分析  用SPSS12.0軟件包分析所得數(shù)據(jù), 比較3組細(xì)胞分泌的aFGF, P<005為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2  結(jié)果

　　2.1  AAV感染HT1080細(xì)胞  將AAV感染AAVHT1080細(xì)胞, 48 h后, 在倒置熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞發(fā)出綠色熒光（圖1）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示, GFP+細(xì)胞數(shù)約占40%。圖1  AAV感染AAVHT1080細(xì)胞（48 h后）

　　2.2  AAV感染內(nèi)皮祖細(xì)胞  由于AAV載體質(zhì)粒pAAVIREShrGFP中含有編碼綠色熒光蛋白（hrGFP）的基因序列, 通過基因克隆的方法, 將spaFGF基因插入到GFP基因的上游, 通過熒光顯微鏡可實時觀察AAV的感染情況。用同樣滴度的AAVspaFGF和AAVGFP分別感染EPC, 在感染細(xì)胞的第4天時, 轉(zhuǎn)導(dǎo)spaFGF基因的EPC和轉(zhuǎn)導(dǎo)GFP基因的EPC均出現(xiàn)綠色熒光（圖2）。

　　圖2  AAV感染的EPC（略）

　　2.3  檢測3組EPC分泌的人aFGF蛋白  轉(zhuǎn)spaFGF基因的EPC分泌的aFGF水平顯著高于轉(zhuǎn)GFP基因EPC和未轉(zhuǎn)基因EPC[（862±49） ng/L vs （115±16） ng/L, （862±49） ng/L vs （98±10） ng/L, P<005, 而后兩組細(xì)胞分泌的aFGF差異無統(tǒng)計學(xué)意義[（115±16） ng/L vs （98±10） ng/L, P>005]。

　　3  討論

　　當(dāng)原先的血管不能提供充足的血流時, 側(cè)支循環(huán)成為一個重要的血液供給的來源, 因此,  研究促血管生長成為治療缺血性心臟病的一個新方向。從動物模型到臨床試驗,對于應(yīng)用細(xì)胞生長因子治療組織缺血性疾病的研究早已開展[4-6], 實驗證實, 在缺血心肌局部注射生長因子能促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的發(fā)展[7]。aFGF是一種有效的促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂劑, 可以通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的激活、 遷移、 增殖和血管周細(xì)胞的募集的機(jī)制促進(jìn)血管生長。aFGF半衰期短, 注射到體內(nèi)很快被清除和降解, 而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可以在較長一段時期內(nèi), 在組織局部維持適當(dāng)濃度的生長因子水平, 達(dá)到治療效果。由于人aFGF缺少信號肽序列,    不能以可溶性方式釋放到細(xì)胞外, 因此, 在臨床試驗中要求對aFGF基因進(jìn)行修飾, 即在aFGF基因的前端加上一段編碼信號肽的基因序列, 構(gòu)成分泌型aFGF基因。重組基因表達(dá)出帶有信號肽的aFGF蛋白, 可分泌到細(xì)胞外, 從而增強(qiáng)其促血管新生作用。本實驗的AAV系統(tǒng)中, spaFGF基因被克隆在載體質(zhì)粒pAAVIREShrGFP的多克隆位點中, 和hrGFP（人重組綠色熒光蛋白）基因由同一個轉(zhuǎn)錄子翻譯, 所以hrGFP的表達(dá)可以被用作確定對目的細(xì)胞的感染效率和作為插入的目的基因的表達(dá)標(biāo)志。重組AAV感染細(xì)胞后, 當(dāng)我們在倒置熒光顯微鏡下能看到綠色熒光時,    提示目的基因已經(jīng)導(dǎo)入細(xì)胞中。在用AAV感染細(xì)胞的過程中, 我們發(fā)現(xiàn), 被同樣數(shù)量的AAV感染后, 不同的細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光的時間不同: 293細(xì)胞被感染24 h后出現(xiàn)綠色熒光; HT1080被感染48 h后出現(xiàn)綠色熒光; 而在EPC中, 至少需要72 h才能出現(xiàn)綠色熒光。流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果反映, AAV對HT1080細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)率高于EPC, 這說明對于不同的細(xì)胞, AAV的感染能力不同。在用AAV感染293和HT1080細(xì)胞時, 我們發(fā)現(xiàn)加入丁酸鈉（濃度為10 mmol/L）, 能增強(qiáng)綠色熒光蛋白的表達(dá), 這可能是因為丁酸鈉通過提高組蛋白的乙酰化, 增強(qiáng)病毒轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。但是, 在將丁酸鈉加入到EPC中時, EPC狀態(tài)明顯變差, 這提示丁酸鈉可能對EPC有毒性作用, 故無法利用丁酸鈉提高外源spaFGF基因在EPC中的表達(dá)。用ELISA法能從轉(zhuǎn)基因的EPC細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測到aFGF蛋白, 本實驗結(jié)果顯示, 與轉(zhuǎn)GFP基因的EPC和未轉(zhuǎn)基因的EPC相比, 轉(zhuǎn)spaFGF基因的EPC分泌的aFGF顯著升高, 說明導(dǎo)入外源性的含有信號肽序列的目的基因可以增加aFGF的表達(dá), 也進(jìn)一步證實spaFGF基因轉(zhuǎn)導(dǎo)EPC是成功的。重組的spaFGF基因?qū)爰?xì)胞后, 能在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄、 翻譯, 表達(dá)帶有信號肽的aFGF蛋白, 這種重組蛋白可沿經(jīng)典分泌途徑分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)液中。基因與細(xì)胞治療心肌和外周組織缺血的研究早已開展[8], 我們選擇EPC和aFGF作為研究對象是因為他們都具有促血管生長作用。冠狀動脈疾病的患者體內(nèi)EPC的數(shù)目和促血管生成能力被減弱, 這限制了EPC的治療作用[9]。聯(lián)合基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞治療也許可以彌補(bǔ)EPC數(shù)目有限所帶來的應(yīng)用缺憾。將重組aFGF循環(huán)基因?qū)隕PC, 為我們下一步觀察生長因子與細(xì)胞結(jié)合促血管生長效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

　　參考文獻(xiàn):

　　[1] YlaHerttuala S, Alitalo K. Gene transfer as a tool to induce therapeutic vascular growth[J]. Nat Med, 2003, 9（6）: 694-701.

　　[2] Tabata H, Silver M, Isner JM. Arterial gene transfer of acidic fibroblast growth factor for therapeutic angiogenesis in vivo: critical role of secretion signal in use of naked DNA[J]. Cardiovasc Res, 1997, 35（3）: 470-479.

　　[3] 陳書艷, 顏雪蕓, 王  飛, 等. aFGF重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2006, 26（10）: 1067-1071.

　　[4] Hughes GC, Post MJ, Simons M, et al. Translational physiology: porcinemodels of human coronary artery disease: implications for preclinical trials of therapeutic angiogenesis[J]. J Appl Physiol, 2003, 94（5）: 1689-1701.

　　[5] Heeschen C, Dimmeler S, Hamm CW, et al. Prognostic significance of angiogenic growth factor serum levels in patients with acute coronary syndromes[J]. Circulation, 2003, 107（4）: 524-530.

　　[6] Douglas W, Stefanie Dimmeler. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease part I: angiogenic cytokines[J]. Circulation, 2004, 109（21）: 2487-2491.

　　[7] Helisch A, Schaper W. Arteriogenesis: the development and growth of collateralarteries[J]. Microcirculation, 2003, 10（1）: 83-97.

　　[8] Melo G, Pachori A, Kong D, et al. Molecular and cellba[x]sed therapies for protection, rescue, and repair of ischemic myocardium reasons for cautious optimism[J]. Circulation, 2004, 109（20）: 2386 -2393.

　　[9] Hill JM, Zalos G, Halcox JP, et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk[J]. N Engl J Med, 2003, 348（7）: 593- 600.

　　作者簡介: 顏雪蕓（1978-）, 女, 上海人, 住院醫(yī)師, 碩士生　Tel: 02152786128, Email: yanxueyun@126.com

　　上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院新華醫(yī)院心血管內(nèi)科, 上海 200092