CCNG2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義術(shù)

        神經(jīng)膠質(zhì)瘤以其高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率和高死亡率已成為臨床亟待解決的難題。占神經(jīng)膠質(zhì)瘤一半的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的平均生存時(shí)間僅約14.6個(gè)月，5年生存率低于3.3%。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞快速且浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與正常腦組織無(wú)明顯界限，多數(shù)發(fā)生不限于一個(gè)腦葉，手術(shù)無(wú)法清除腫瘤病灶陋。不同部位病理特征不同，其惡性程度也不同，單純手術(shù)和放化療不能阻止腫瘤復(fù)發(fā)和向周圍腦組織發(fā)生侵襲性轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)率高達(dá)，其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制目前尚未完全闡明。因此闈明影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的分子機(jī)制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床治療尋找新的靶點(diǎn)，已成為當(dāng)今神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床治療學(xué)的熱點(diǎn)課題之一。 細(xì)胞周期蛋白G2( cell cyclin，G2)由CCNG2基因編碼，與c:vclin CJI同屬于細(xì)胞周期蛋白G家族。CCNG2基因定位于染色體Sp3.3，編碼基因含有8個(gè)外娃子，其cDNA長(zhǎng)度約8.60 kb，相對(duì)分子為40x103。人類CCNG2與CCNGI娘示了較低的同源性，僅有60%的核苷酸序列及53%的氨基酸序列一致；而與Cyc:lin A的氨基酸序列則只有26%的一致性№：。日前的研究發(fā)現(xiàn)CCNG2可能參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展和化療耐藥過(guò)程為了驗(yàn)證神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中CCNG2的表達(dá)情況及其與臨床預(yù)后的關(guān)系，本研究應(yīng)用QRT-PCR及免疫組織化學(xué)的方法對(duì)臨床神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

        1 材料與方法

        1.1材料
        收集2007年1月至2012年8月在本院行手術(shù)切除的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本149例，選擇資料完整的神經(jīng)膠質(zhì)瘤病例1 09例進(jìn)行研究，手術(shù)標(biāo)本部分經(jīng)40 g/L中性甲醛固定，石蠟包埋，3μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。部分手術(shù)標(biāo)本放人液氮冷凍后，用錫紙包裹，在研缽中充分研磨，研磨后用Trizol反復(fù)洗滌研磨的碎末，用經(jīng)DEPC水處理后的凍存管收集，放人液氮，用時(shí)提取RNA進(jìn)行檢測(cè)。所有病例術(shù)前均未行放化療。本研究經(jīng)珠江醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。隨訪：全部109例患者出院后均隨訪，隨訪方式為電話隨訪和復(fù)查隨訪，隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀及影像學(xué)檢查。隨訪起點(diǎn)為確診日期，末次隨訪時(shí)間為2013年5月31日，至隨訪截止日，依然生存46例，死亡63例，無(wú)失訪病例。

        1.2方法
        1.2.1 總RNA的提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照試劑說(shuō)明書，通過(guò)Trizol提取試劑盒從神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中提取總RNA，操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。測(cè)量總RNA濃度，取lpLg RNA按逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說(shuō)明合成c:DNA，然后以該CDNA力模板，PCR儀中擴(kuò)增從神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。CCNG2及內(nèi)參照GAPDH的引物序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR擴(kuò)增參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，以CCNG2基因的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2。△們‘的方法進(jìn)行分析?！鳌鰿t=（待測(cè)樣品的目的基因的Ct的平均值一待測(cè)樣本的管家基因的Ct的平均值）一（對(duì)照樣品的目的基因的Ct的平均值一對(duì)照樣本的管家基因的Ct的平均值）。 

        1.2.2免疫組織化學(xué)染色石蠟切片、脫蠟、水化，PBS沖洗3x3 min，高溫高壓抗原修復(fù)。加3%過(guò)氧化氫溶液，室溫下孵育IO min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS沖洗3x3 min，加抗體，一抗CCNG2為鼠抗人單克隆抗體。室溫下孵育60 min.PBS沖洗3x5 min。加聚合物增強(qiáng)劑（試劑A），室溫孵育20 min，PBS沖洗3x3 min。加酶標(biāo)抗鼠聚合物（試劑B），室溫T孵育30 min，PBS沖洗3x3 min。加新配制的DAB娩色液，娃微鏡下觀察，陽(yáng)性娃色為棕黃色。自來(lái)水沖洗，蘇術(shù)素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來(lái)水沖洗，PBS沖洗返藍(lán)。梯度酒精脫水干燥，中性樹脂封片，所有標(biāo)記均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照并用PBS緩沖液代替一抗行陰性對(duì)照。免疫組織化學(xué)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量判定。切片由兩位病理學(xué)醫(yī)師重復(fù)觀察，結(jié)果有分歧時(shí)南第三人觀片，討論判定。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，按照細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。如果陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為+，10% - 29%為++，30% - 49%為+++，≥50%為++++。

        1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。CCNG2在各級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)差異采用單因素方差分析的方法，CCNG2的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用Chi-Square檢驗(yàn)，采用Ka-plan-Meier法分析CCNG2的表達(dá)與生存期的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果
        2.1 CCNG2基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)
        QRT-PCR法檢測(cè)CCNG2在非腫瘤組織（包括癌旁組織和正常腦組織）及神經(jīng)膠質(zhì)瘤各級(jí)組織標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果提示CCNG2基因的表達(dá)水平隨著神經(jīng)膠魘瘤惡性程度的增高而降低，并且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理級(jí)別呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05，圖1)。 

        免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CCNG2在各級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果提示CCNG2陽(yáng)性細(xì)胞分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜著色（圖2）。CCNG2表達(dá)水平隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的增高而降低，并且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理級(jí)別呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        2.3 CCNG2的表達(dá)及其與臨床參數(shù)的關(guān)系

        患者中男性94例，女性15例?；颊吣挲g36 - 86歲，中位年齡60歲，60歲以下患者54例，60歲以上患者55例。神經(jīng)膠質(zhì)瘤I級(jí)患者19例，Ⅱ級(jí)29例，Ⅲ級(jí)26例，Ⅳ級(jí)35例?；熋舾姓撸ɑ熀?個(gè)月未見腫瘤復(fù)發(fā)或疾病處于穩(wěn)定狀態(tài)）73例，化療抗拒者 （化療后3個(gè)月內(nèi)f|I現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移）36例。放療敏感者（放療后3個(gè)月未見腫瘤復(fù)發(fā)或疾病處于穩(wěn)定狀態(tài)）44例，放療抗拒者（放療后3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移）65例。截止研究“工作完成，生存病例46例，死亡病例63例。CCNG2蛋白的表達(dá)與患者性別、年齡無(wú)關(guān)（均P>0.05）；而與腫瘤的分級(jí)、對(duì)放化療的敏感性及總生存時(shí)間相關(guān)（均P<0.05，表2）。 

        2.4 CCNG2及臨床各參數(shù)對(duì)患者生存時(shí)間的影響
        采用Kaplan-Meier法估計(jì)患者生存時(shí)問，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCNG2的表達(dá)、患者對(duì)放化療的敏感性及腫瘤的分級(jí)與患者的生存時(shí)間密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中高表達(dá)CCNG2患者的生存時(shí)間較低表達(dá)者明艟增加。腫瘤的病理分級(jí)越高，患者的生存時(shí)間越短，放化療敏感者的生存時(shí)間較抗拒者的生存時(shí)間艮，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖3)。 

        3 討論
        神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的45% - 50%，也是顱內(nèi)腫瘤患者的主要死亡病因之一8-10。神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO分為I -Ⅳ級(jí)。除I級(jí)以外，幾乎所有低緞別神經(jīng)膠質(zhì)瘤終均進(jìn)展到別惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤，即Ⅳ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤( glioblastoma，GBM。后者是常見、惡性程度高的神經(jīng)膠質(zhì)瘤。GBM患者的治療方法是外科手術(shù)結(jié)合放療、化療，其中化療以烷基化藥物替莫唑胺( temozolomide，TMZ)為主，聯(lián)合或未聯(lián)合應(yīng)用亞硝基脲類。盡管這些治療方案有了長(zhǎng)足的發(fā)展，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者終預(yù)后極差，目前中位生存期仍未超過(guò)14個(gè)月。因此深入研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展以及化療耐藥產(chǎn)生的分子機(jī)制對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷與治療具有十分重要的意義。

        日前研究CCNG2功能的文獻(xiàn)較少，主要集中在1) CCNG2是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子，能夠抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程。CCNG2是潛在的抑癌基因，其表達(dá)的缺失可能參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程。然而關(guān)于CCNG2在細(xì)胞周期中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未完全清楚。目前有研究報(bào)道CCNG2可能參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展和化療耐藥過(guò)程陽(yáng)們。為了驗(yàn)證神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中CCNG2的表達(dá)情況，本研究應(yīng)用QRT-PCR及免疫組織化學(xué)的方法在收集到的臨床神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本上進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中存在CCNG2 mRNAT調(diào)現(xiàn)象，其中別（WHOⅢ～Ⅳ級(jí)）神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中CCNG2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明艟下調(diào)，與低級(jí)別（WHO I-Ⅱ級(jí)）神經(jīng)膠質(zhì)瘤相比差別著(P<0.05)。本研究對(duì)109例免疫組織化學(xué)標(biāo)本的分析表明，低級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可見CCNG2蛋白染色，隨著腫瘤級(jí)別的增高，CCNG2蛋白陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)。別神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織陽(yáng)性率明艟低于低級(jí)別組(P<0.05)。 Kaplan-Meier生存曲線提示CCNG2蛋白高表達(dá)患者預(yù)后好于低表達(dá)者，CCNG2的表達(dá)與患者性別、年齡無(wú)關(guān)（均P>0.05），而與腫瘤的分級(jí)、對(duì)放化療的敏感性及總生存時(shí)間相關(guān)。本研究將有助于闡明神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展及放化療抗拒的分子機(jī)制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床治療尋找新的靶點(diǎn)。