西藏小型豬ESR基因PvuⅡ多態(tài)性與生長(zhǎng)繁殖性能相關(guān)分析

作者：曾昭智,江濤,張錦紅　　作者單位：廣東藥學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510006; 南方醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州

　　【摘要】目的 了解ESR基因PvuⅡ位點(diǎn)在西藏小型豬中的多態(tài)性分布情況;研究其在西藏小型豬上的遺傳效應(yīng)，為西藏小型豬生長(zhǎng)繁殖性狀的分子遺傳標(biāo)記輔助選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 記錄44頭西藏小型豬母豬繁殖性能，并對(duì)其所產(chǎn)仔豬的生長(zhǎng)性能進(jìn)行測(cè)定，采用PCRRFLP方法對(duì)ESR基因PvuⅡ位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性與生長(zhǎng)繁殖性能進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 西藏小型豬ESR候選基因PvuⅡ位點(diǎn)表現(xiàn)出多態(tài)性，為AA、AB、BB型，A、B等位基因頻率特征。初產(chǎn)胎的產(chǎn)仔數(shù)在不同基因型間差異存在顯著性，不同基因型間產(chǎn)仔數(shù)呈BB>AB>AA的趨勢(shì)，初產(chǎn)胎和經(jīng)產(chǎn)胎的母豬其他指標(biāo)在不同基因型間差異均沒有顯著性。結(jié)論 提高西藏小型豬豬群ESR基因PvuⅡ位點(diǎn)B等位基因頻率，有利于提高西藏小型母豬的產(chǎn)仔數(shù)。
　　【關(guān)鍵詞】 西藏小型豬 ESR基因 多態(tài)性 生長(zhǎng)繁殖性能 相關(guān)分析

　　Correlation analysis of the relationship between PvuⅡ polymorphisms of ESR gene and growth and reproduction traits of Tibet minipig

　　ZENG Zhaozhi，JIANG Tao，ZHANG Jinhong， GU Weiwang

　　(Laboratory Animal Center, Guangdong Pharmaceutical College, Guangzhou,Guangdong 510006;Laboratory Animal Center, Southern Medical University, Guangzhou,Guangdong 510515, China)

　　Abstract:ob[x]jective To obtain the information on PvuⅡpolymorphism distribution of ESR gene and study its genetic effect on Tibet minipigs to provide experimental evidence for molecule genetic marker selection of growth and reproductive traits. Methods Growth and reproduction traits of 44 Tibet minipigs were recorded. The PvuⅡ polymorphism of ESR gene was detected by PCRRFLP and the relationship between polymorphism and growth and reproduction performance was analyzed. Results The genotypes were AA, AB, BB with A and B were alleles. TBN(total birth number)of the primiparous sows was significantly different between different genotypes and the tendency of TBN between different genotypes was BB>AB>AA, other index between primiparous sows and parous sows showed no significant difference. Conclusion The study results demonstrated that improving allele frequency of B allele of ESR gene might be helpful to improve TBN of Tibet minipigs.

　　Key words:Tibet minipig; ESR gene;PvuⅡpolymorphisms;growth and reproduction traits; correlation analysis

　　近年來，對(duì)影響動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)性狀(數(shù)量性狀)主基因的研究成為遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。而產(chǎn)仔數(shù)作為一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，更是研究的重點(diǎn)，近期對(duì)產(chǎn)仔數(shù)有顯著或較顯著關(guān)聯(lián)的候選基因雌激素受體(ESR)基因和催乳素受體(PRLR)基因研究較為突出[1]，1991年Rothschild[2]報(bào)道了豬ESR位點(diǎn)的Pvu Ⅱ多態(tài)性，探討過這種多態(tài)性與生長(zhǎng)繁殖性能間的關(guān)系。
　　由于西藏小型豬是我國(guó)優(yōu)良地方豬種，產(chǎn)于我國(guó)青藏高原，是典型的高原型放牧豬種[3]，很難收集到關(guān)于生產(chǎn)性能和繁殖性能的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，故對(duì)西藏小型豬功能基因與生長(zhǎng)繁殖性能的研究還未見報(bào)道。本研究對(duì)西藏小型豬ESR基因的PvuⅡ位點(diǎn)多態(tài)性分析與生長(zhǎng)繁殖性能進(jìn)行相關(guān)性研究，研究其在西藏小型豬上的遺傳效應(yīng)，為進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供依據(jù)，以提高西藏小型豬的生長(zhǎng)繁殖性能，也為實(shí)現(xiàn)我國(guó)特有小型豬資源西藏小型豬的選育保種、開發(fā)利用和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[4]。
　　1 材料與方法
　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　1.1.1 樣本來源 南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心西藏小型豬基地隨機(jī)抽取44頭西藏小型豬母豬采其耳組織樣品，每頭豬取一小塊耳組織放入準(zhǔn)備好的EP管中，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室備用。
　　1.1.2 數(shù)據(jù)收集 收集了采樣西藏小型豬母豬的初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)胎的產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和離乳成活數(shù)以及所產(chǎn)仔豬的初生體質(zhì)量、離乳體質(zhì)量(60日齡體質(zhì)量)等相關(guān)的生長(zhǎng)繁殖數(shù)據(jù)。
　　1.2 試驗(yàn)方法

　　1.2.1 基因組DNA的抽提 采西藏小型豬耳組織塊，切取10 mg左右的動(dòng)物組織材料，用試劑盒的方法提取基因組DNA并用用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， DNA提好后保存在-20 ℃，以防DNA降解。
　　1.2.2 目的基因的擴(kuò)增 引用Short[5]設(shè)計(jì)的豬ESR基因的引物：Forward primer：5’CCTGTTTTT ACAGTGACTTTTACAGAG3’，Reverse primer：5’CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG3’，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，擴(kuò)增的特異性片斷長(zhǎng)度約為120 bp,位于ESR基因的第5外顯子。PCR反應(yīng)體系：10 × PCR buffer(無Mg2+)：2.5 μL，Mg2+(25 mmol/L)：1.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)：0.5 μL，Primer 1(25 mmol/L)：0.05 μL，Primer 2(25 mmol/L)：0.05 μL，Template DNA：3.0 μL，Taq酶
　　(5 U/μL)：0.5 μL，去離子水：16.9 μL，共25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)入如下循環(huán)(共35個(gè))：94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min。循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸8 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否在所需的長(zhǎng)度范圍內(nèi)以及是否有非特異帶產(chǎn)生。
　　1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的RFLP分析及基因型判定 酶切反應(yīng)體系：buffer：2.0 μL，PCR產(chǎn)物：10 μL， Pvu II (10 U/μL)：1 μL，去離子水：17 μL，在37 ℃水浴中酶切消化過夜，形成3種基因型：AA基因型(120 bp/120 bp)，AB基因型(120 bp/65 bp+55 bp), BB基因型(65 bp+55 bp/65 bp+55 bp)。由于酶切后片段的分子量相差不大，故采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行酶切產(chǎn)物檢測(cè)，用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描記錄電泳圖譜，統(tǒng)計(jì)基因型。
　　1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)基因型的個(gè)數(shù)及基因型頻率以及各等位基因的基因頻率。通過計(jì)算各基因座位基因型的生長(zhǎng)繁殖性能表型平均值，運(yùn)用軟件分析SPSS10.0 for Windows中單向方差分析檢測(cè)各基因型生長(zhǎng)繁殖性能的差異。多組間兩兩比較用LSD方法。
　　2 結(jié)果

　　2.1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果

　　PCR擴(kuò)增西藏小型豬雌激素受體基因所得產(chǎn)物片段為120 bp，如圖1。
　　1～18示雌激素受體基因擴(kuò)增產(chǎn)物，M為Marker(DL2000)

　　圖1 雌激素受體基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(略)

　　Figure 1 Electrophoresis pattern of PCR products of ESR gene

　　2.2 西藏小型豬ESR基因PCRRFLP分析

　　擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Pvu II消化，經(jīng)過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)照相后可觀察到圖2所示的圖像。
　　2.3 西藏小型豬ESR基因型和基因頻率統(tǒng)計(jì)

　　在本次所測(cè)的西藏小型豬中,基因位點(diǎn)同樣出現(xiàn)了3種基因型，其中ESR基因AA型母豬有12頭，基因型頻率為0.273;AB型母豬有22頭，基因型頻率為0.500，BB型母豬有10頭，基因型頻率為0.227;其中A等位基因頻率為0.523，B等位基因頻率為0.477。
　　6為純合子AA型; 5、7、8為純合子BB型;1、2、3、4、9為AB型;M為Marker (DL500)

　　圖2 ESR基因Pvu II酶切產(chǎn)物電泳圖(略)

　　Figure 2 Electrophoresis pattern of Pvu IIRFLP of ESR gene PCR products in Tibetan pigs

　　2.4 西藏小型豬ESR基因擴(kuò)增片斷Pvu II多態(tài)性與生長(zhǎng)繁殖性狀間的關(guān)系

　　整理收集采樣西藏小型豬母豬的初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)胎的產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和離乳成活數(shù)以及所產(chǎn)仔豬的初生體質(zhì)量、離乳體質(zhì)量(60日齡體質(zhì)量)等相關(guān)的生長(zhǎng)繁殖數(shù)據(jù)，得到西藏小型豬ESR基因座位不同基因型繁殖性能和早期生長(zhǎng)性能數(shù)據(jù)，見表1、表2。
　　由表1、表2可以看出：在ESR基因中，初產(chǎn)胎的產(chǎn)仔數(shù)在不同基因型差異有顯著性 (F=3.579,P<0.05)，不同基因型間產(chǎn)仔數(shù)呈現(xiàn)BB>AB>AA的趨勢(shì)， BB基因型母豬的產(chǎn)仔數(shù)分別比AB型和AA型母豬多0.264頭和1.400頭，初產(chǎn)胎和經(jīng)產(chǎn)胎的其他指標(biāo)在不同基因型間差異均無顯著性(P>0.05)。
　　表1 西藏小型豬ESR基因座位繁殖性能的基本統(tǒng)計(jì)資料(略)

　　Table 1 ESR genotypes and their reproduction performances in Tibet minipigs

　　與不同基因型間比較：*P<0.05

　　表2 西藏小型豬ESR基因座位早期生長(zhǎng)性能的基本統(tǒng)計(jì)資料(略)

　　Table 2 ESR genotypes and their early growth performances in Tibet minipigs

　　3 討論

　　3.1 ESR基因的基因型及基因頻率的分布

　　從整體上來看，與其他豬種相比可以看出西藏小型豬的A等位基因頻率和B等位基因頻率與梅山豬接近，并且與熊統(tǒng)安[6]等報(bào)道的有關(guān)西藏小型豬ESR基因多態(tài)性分析的結(jié)果一致;其中A等位基因頻率比萊蕪豬、長(zhǎng)白豬、大白豬低，B等位基因頻率比其他大部分的地方豬種要低一些。ESR基因的A、B等位基因的基因頻率很接近，都接近0.500，這也說明西藏小型豬選擇壓力較小, ESR基因的分布處于原始的自然狀態(tài)。
　　3.2 西藏小型豬ESR基因擴(kuò)增片斷Pvu II多態(tài)性與生長(zhǎng)繁殖性狀間的關(guān)聯(lián)性
　　在本研究中，西藏小型豬ESR基因初產(chǎn)胎的產(chǎn)仔數(shù)在不同基因型間差異有顯著性 (P<0.05)，不同基因型間產(chǎn)仔數(shù)呈現(xiàn)BB>AB>AA的趨勢(shì)， BB基因型母豬的產(chǎn)仔數(shù)分別比AB型和AA型母豬多0.264頭和1.400頭，初產(chǎn)胎和經(jīng)產(chǎn)胎的其他指標(biāo)在不同基因型間差異無顯著性( P>0.05)。Rothschild[7]等用含50%梅山豬血緣的2個(gè)合成系涉及50個(gè)全同胞家系161頭母豬為材料，對(duì)ESR基因進(jìn)行PFLPs分析，用Pvu Il酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，純合子BB母豬胎產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)都比純合子AA母豬多2.3頭(P<0.01)，比所有胎次多1.5頭(P<0.01)。后在PIC合成系(含大白豬血緣)發(fā)現(xiàn)BB比AA母豬胎產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)高1.2頭，所有胎次高0.9頭。對(duì)上述2次試驗(yàn)?zāi)肛i群均記錄了生長(zhǎng)速度和背膘厚，分析后發(fā)現(xiàn)ESR位點(diǎn)不同基因型性狀均值間差異不顯著。張淑君[8,9]等同樣采用PCRRFLPs方法分析了長(zhǎng)白與大白雜交豬、二花臉豬和大白豬的ESR位點(diǎn)的多態(tài)性，并分析了多態(tài)性與母豬產(chǎn)仔數(shù)性能之間的相關(guān)性。結(jié)果表明:ESR位點(diǎn)在2個(gè)品種和長(zhǎng)白與大白雜交母豬中均存在多態(tài)性，ESR位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)仔數(shù)的影響趨勢(shì)為BB>AB>AA。本研究結(jié)果與他人報(bào)道的基本一致,但是不同的基因型間產(chǎn)仔數(shù)的差異沒有其他人所報(bào)道的大，這主要是跟西藏小型豬的繁殖性能不高的品種特性有關(guān)。另外，西藏小型豬仔豬的初生體質(zhì)量和離乳體質(zhì)量在不同的基因型間差異均無顯著性，這與田勇等的研究結(jié)果一致[10]，說明ESR基因多態(tài)性對(duì)生長(zhǎng)性能的影響不是很明顯，所以在考慮ESR基因?qū)ξ鞑匦⌒拓i生長(zhǎng)繁殖性能的影響時(shí)，主要是考慮ESR基因?qū)Ψ敝承阅芊矫娴挠绊?，而?duì)生長(zhǎng)性能方面的影響可以不用考慮。
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