資訊
頻道
當前位置:首頁 > 醫(yī)療器械資訊 > 學術論文 > 2甲氧基雌二醇對SKM1細胞凋亡中bcl2/bax表達的影響

2甲氧基雌二醇對SKM1細胞凋亡中bcl2/bax表達的影響

文章來源:創(chuàng)新醫(yī)學網(wǎng)發(fā)布日期:2012-12-08瀏覽次數(shù):31954

  作者:夏國華,陳寶安,蘆慧霞,邵澤葉,丁家華  作者單位:東南大學醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學系,江蘇 南京 210009

  【摘要】目的探討2甲氧基雌二醇(2ME)對骨髓增生異常綜合征SKM1細胞凋亡過程中bcl2/bax表達的影響。方法 2ME與SKM1細胞共同培養(yǎng),流式細胞術分析細胞凋亡率和細胞周期;RTPCR技術檢測bcl2和bax mRNA表達。結(jié)果 1~8 μmol/L 2ME作用后,SKM1細胞凋亡率上升呈劑量依賴性;細胞被阻滯于G2/M期;細胞bcl2 mRNA表達量下調(diào),bax mRNA表達量上調(diào)。結(jié)論 2ME誘導SKM1細胞凋亡與細胞G2/M期阻滯和bcl2/bax比率下降有關。
  【關鍵詞】 2甲氧基雌二醇;SKM1細胞系;凋亡;細胞周期;bcl2/bax

  【Abstract】 ob[x]jective To explore the effect of 2methoxyestradiol(2ME) on cell apoptosis and the ex[x]pression of bcl2/bax ratio in myelodysplastic syndromes SKM1 cells. Methods After SKM1 cells were treated with different concentration of 2ME for several period of time, the rate of apoptosis and cell cycle status were evaluated by FCM, and the ex[x]pressions of bcl2 and bax mRNA were assayed by reverse transc[x]ription polymerase chain reaction(RTPCR).Results Different concentration of 2ME increased the rate of apoptosis in a timedependent manner and caused a sustained arrest at G2/M phase. Furthermore, 2ME significantly downregulated the ex[x]pression of bcl2 mRNA (P<0.05) and upregulated the ex[x]pression of Bax mRNA (P<0.05). Conclusions 2ME could induce SKM1 cell apoptosis by arresting cell cycle at G2/M phase and decrease the ratio of bax/bcl2.

  【Key words】 2methoxyestradiol; SKM1 cell line; Apoptosis; Cell cycle; Bax/bcl2

  骨髓增生異常綜合征(MDS) 是血液系統(tǒng)的常見疾病之一,多發(fā)于老年人。有研究發(fā)現(xiàn)早期MDS患者的骨髓造血細胞過度凋亡,引起骨髓無效造血致外周血細胞減少〔1〕;但隨著疾病進展到晚期,患者骨髓細胞的凋亡受到抑制,發(fā)生惡性克隆增殖,終可能轉(zhuǎn)化為白血病。因此臨床上迫切需要研究和開發(fā)新的低毒性的化療藥物,通過誘導MDS惡性克隆細胞凋亡來恢復正常造血。2甲氧基雌二醇(2ME)是近年來研究的新型抗腫瘤藥物,可誘導多種腫瘤細胞凋亡,臨床副作用小,作為潛在的和合適的癌癥治療藥物而引起人們的關注〔2〕。本實驗以人MDSRAEB細胞株SKM1為體外研究模型,初步探討2ME誘導SKM1細胞凋亡的作用機制。
  1 材料與方法
  1.1 主要儀器和試劑
  FACS Calibur流式細胞儀(Becton Dickinson公司);梯度PCR儀(Eppendorf公司)。2ME、二甲基亞砜(Sigma公司);RPMI1640 (Gibco公司);Trizol提取液(Invitrogen公司);RTPCR試劑盒(TaKaRa公司);AnnexinVFITC/PI凋亡試劑盒(Becton Dickinson公司)。
  1.2 細胞培養(yǎng)與預處理

  SKM1細胞系(日本JCRB細胞庫)。SKM1細胞在37℃、5% CO2、含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞進行實驗,實驗設對照組和2ME(1、2、4和8 μmol/L)用藥組。
  1.3 細胞凋亡率檢測
  收集1×106個細胞,冷PBS洗滌2次,懸浮細胞,加5 μl AnnexinVFITC,室溫避光10 min,再加10 μl PI,混合后室溫避光5 min,冷PBS洗滌1次,懸浮細胞,F(xiàn)CM檢測。
  1.4 細胞周期分析

  收集1×106個細胞,PBS洗2次,70%冷乙醇固定,1 ml PI(50 μg/ml)染液混勻后避光放置30 min,F(xiàn)CM檢測,用專業(yè)軟件ModFit獲取分析數(shù)據(jù)。
  1.5 RTPCR檢測bcl2和bax mRNA表達

  收集細胞提取總RNA,紫外分光光度儀測定OD260nm/OD280nm(1.8~2.0),計算RNA含量。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再對其進行擴增,以βactin為內(nèi)參照。引物序列如下:bcl2(452 bp):上游5′GGAGAACAGGGTACGATA A3′,下游5′CCACCGAACTCAAAGAAGG3′;bax(275 bp):上游5′GAGGATGATTGCCGCCGTGGACA3′,下游5′GGTGGGGGTGAGGAGGCTTGAGG3′;βactin(150 bp):上游5′TATGACTTAGTTGCGTTACACC3′,下游5′CCTTCACCGTTCCAGTTT3′。反應參數(shù):94℃ 5 min;94℃ 1 min,55℃ 45 s,72℃ 1 min共30循環(huán);后72℃ 延伸10 min。取10 μl擴增產(chǎn)物與2 μl 6×loading緩沖液混合后,在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,柯達UV2000紫外分析儀觀察和掃描分析目的基因與βactin灰度比值,進行目的基因表達的半定量分析。
  1.6 統(tǒng)計學方法
  采用SPSS13.5統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)用x±s表示,采用t檢驗和方差分析。
  2 結(jié) 果
  2.1 2ME對SKM1細胞凋亡的影響
  2ME作用12 h,Annexin+/PI-的細胞較對照組細胞顯著增加(P<0.05)。表明2ME是SKM1細胞強有力的凋亡誘導劑,細胞凋亡呈劑量依賴關系。見表1。表1 不同濃度2ME作用SKM1細胞12 h對細胞周期及凋亡率的影響

  2.2 2ME對SKM1細胞周期的影響
  隨著2ME劑量的增加,G2/M期細胞逐漸增多,G0/G1和S期細胞逐漸減少,與對照組比較均有顯著差異(P<0.05),提示SKM1細胞被2ME阻滯于G2/M期。見表1。
  2.3 2ME對bcl2和bax的mRNA影響

  經(jīng)2ME處理48 h,隨著2ME濃度的增加,SKM1細胞bcl2 mRNA表達量下調(diào),而bax mRNA表達量上調(diào)。方差分析表明,各處理組bcl2和bax表達量與對照組相比差異顯著(P<0.05),表明2ME可以下調(diào)SKM1細胞中bcl2/bax的比率。見圖1。1:空白對照組,2:1 μmol/L 2ME組,3:2 μmol/L 2ME組,4:4 μmol/L 2ME組,M:Marker圖1 2ME對SKM1細胞bcl2和bax mRNA表達的影響
  3 討 論
  MDS是以血細胞質(zhì)、量異常和高風險發(fā)展為急性白血病為特征的惡性克隆性造血干細胞病,大多數(shù)病人不能進行異基因造血干細胞移植,臨床上尋找有效、經(jīng)濟的治療方法,以提高治療效果、延長生存期及改善患者生存質(zhì)量,具有重要意義。2ME是近年來研究的新型抗腫瘤藥物,具有廣泛的抗腫瘤活性和對白血病細胞選擇性殺傷作用〔3〕。本研究中AnnexinVFITC結(jié)合PI染色結(jié)果顯示,經(jīng)1~8 μmol/L 2ME作用SKM1細胞48 h時各用藥組Annexin+/PI-細胞較對照組顯著增加,表明2ME是SKM1細胞強有力的凋亡誘導劑。不同濃度2ME對SKM1細胞周期各時相均有影響,隨著2ME劑量的增加,G2/M期細胞比例逐漸上升,G1和S期細胞逐漸減少,提示SKM1細胞被2ME阻滯于G2/M期,這是細胞損傷的普遍現(xiàn)象。
  細胞凋亡是機體維持自身平衡的一種基本生理機制,在細胞凋亡的分子生物學過程中,細胞凋亡受多種基因的調(diào)控,Bcl2基因家族是一類新的癌基因家族,在細胞凋亡調(diào)控中起重要作用。bcl2凋亡控制基因家族中抗凋亡成員和促凋亡成員之間可競爭性形成同源或異源二聚體,即bcl2/bax、bclX/bax和mcl1/bax的比率決定細胞是否凋亡〔4〕。bcl2表達降低在線粒體通路中起關鍵性的作用,很多化療藥物通過抑制下調(diào)抗凋亡基因bcl2的表達,促使Ca2+內(nèi)流,直接或間接改變線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運通道,降低ΔΨm,促進CytC和促凋亡因子的釋放,與caspase9形成凋亡復合體,啟動caspase3級聯(lián)反應,誘導腫瘤細胞凋亡。bax基因本身并不直接誘導細胞死亡,但能加速死亡信號引起細胞凋亡的基因。本研究發(fā)現(xiàn)2ME下調(diào)SKM1細胞中bcl2 mRNA表達和上調(diào)bax mRNA表達,即bcl2/bax比率下降,而2ME對MDS細胞株MUTZ1細胞中bax mRNA表達量無明顯影響〔5〕,表明bax基因在MDS不同細胞株中表達量不同,在加速細胞凋亡中的作用也不完全相同。
  總之,2ME誘導SKM1細胞凋亡與細胞G2/M期阻滯和bcl2/bax比率下降有關。
  【參考文獻】
  1 Parker JE,Mufti J.Ineffective haemopoiesis and apoptosis in myelodysplastic syndromes〔J〕.Hematology,1998;101(2):22030.

  2 Sidor C,D′amato R,Miller KD,et al.The potential and suitability of 2methoxyestradiol in cancer therapy〔J〕.Clin Cancer Res,2005;11(16):60945.

  3 Huang P,F(xiàn)eng L,Oldham EA,et al.Superoxide dismutase as a target for the selective killing of cancer cells〔J〕.Nature,2000;407(6802):3905.

  4 Jacobson MD.Apoptosis:Bcl2related proteins get connected〔J〕.Curr Biol,1997;7(5):R27781.

  5 夏國華,陳寶安,蘆慧霞,等.Mcl1和Bax基因在2甲氧基雌二醇誘導骨髓增生異常綜合征細胞凋亡中的調(diào)控作用〔J〕.中國實驗血液雜志,2009;17(5):12468.