5AzaCdR對(duì)腎細(xì)胞癌Caki1細(xì)胞生長(zhǎng)及E鈣黏蛋白基因表達(dá)的影響

    作者：何鴻保,孫浩,姚宏偉,唐愛國(guó)　　作者單位：江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科

　　【摘要】目的:研究甲基化抑制劑5氮雜2′脫氧胞苷(5 AzaCdR)對(duì)腎細(xì)胞癌細(xì)胞株Caki1增殖抑制作用、對(duì)E鈣黏蛋白(Ecadherin，Ecad)甲基化狀態(tài)及Ecad蛋白狀態(tài)的影響。方法： 不同濃度5AzaCdR處理腎細(xì)胞癌細(xì)胞株Caki1后，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞經(jīng)藥物處理前后的生長(zhǎng)活性;甲基化特異性PCR(methylation special PCR，MSP)檢測(cè)細(xì)胞處理前后Ecad基因的甲基化狀態(tài);蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)5AzaCdR處理細(xì)胞前后Ecad蛋白的表達(dá)。結(jié)果： 5AzaCdR能抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞株Caki1的增殖;未經(jīng)藥物處理組的基因高甲基化，經(jīng)10-6 mol/L 5AzaCdR處理72 h，Ecad基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化得到逆轉(zhuǎn)，同時(shí)Ecad蛋白表達(dá)也得到增強(qiáng)。結(jié)論： 5AzaCdR能夠有效逆轉(zhuǎn)Caki1細(xì)胞Ecad基因的異常甲基化，恢復(fù)Ecad蛋白表達(dá)。

　　【關(guān)鍵詞】5氮雜2′脫氧胞苷;腎細(xì)胞癌;E鈣黏蛋白;DNA甲基化;

　　[Abstract] ob[x]jective: To investigate the effects of methylation inhibitor 5Aza2′deoxycytidine on the growth of renal clear cell carcinoma cell line Caki1 and the ex[x]pression of the Ecadherin(Ecad) gene and protein. Methods: Renal clear cell carcinoma cell line Caki1 were treated with different concentration of 5AzaCdR respectively. Then the growth rate of the cells was detected by MTT assay. The methylation and demethylation status of Ecad gene were detected by methylation special PCR(MSP).The western blot was used to detect Ecad protein levels in the cell line before and after treatment with 5AzaCdR. Results: 5AzaCdR can inhibit the growth of renal clear cell carcinoma Caki1.The high methylation status of Ecad gene promoter region was reversed with 10-6 mol/L 5AzaCdR treated for 72 h， while Ecad protein ex[x]pression was also enhanced. Conclusion: 5AzaCdR effectively caused the demethylation of Ecad gene， and recovered the Ecad protein ex[x]pression.

　　[Key words] 5Aza2′deoxycytidine;renal clear cell carcinoma;Ecadherin;DNA methylation

　　腎細(xì)胞癌的發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)腫瘤的第二位，目前的治療仍以性手術(shù)為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率達(dá)20%以上，且放化療效果不佳，因此迫切需要早期診斷方法和其他有效的治療。腎細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，抑癌基因失活是關(guān)鍵因素之一，抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突變和啟動(dòng)子區(qū)域的過甲基化等[1]。研究發(fā)現(xiàn)，E鈣黏蛋白(Ecadherin，Ecad)是一類介導(dǎo)細(xì)胞之間互相黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，它在胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、上皮極性和完整性維持等方面起著重要作用[2]。近年來研究表明，Ecad和腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有著重要關(guān)系，其在胃癌、腸癌、前列腺癌及乳腺小葉癌組織中表達(dá)下調(diào)，Ecad基因啟動(dòng)子甲基化是其表達(dá)缺失的主要原因[3]。DNA 甲基化是一種發(fā)生在CpG二核苷酸上對(duì)胞嘧啶的共價(jià)修飾，是基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控方式之一，它不存在 DNA 序列改變，是表觀遺傳學(xué)的一種[4]。為探討Ecad基因甲基化與腎細(xì)胞癌的關(guān)系及臨床意義，我們進(jìn)行了相關(guān)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　牛血清(杭州四季青公司);McCoy′s 5A培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)、胰酶(武漢博士德公司); 5氮雜2′脫氧胞苷(5AzaCdR)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma公司)，5AzaCdR用培養(yǎng)基充分溶解后保存于-70 ℃冰箱備用;通用DNA提取試劑盒3.0及TaKaRa Ex Taq(大連寶生物工程有限公司);DNA甲基化修飾試劑盒(北京天漠科技開發(fā)有限公司);鼠抗人一抗、羊抗鼠二抗(美國(guó)賽信通公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 腎細(xì)胞癌細(xì)胞株的培養(yǎng)

　　腎細(xì)胞癌細(xì)胞株Caki1購于上海中科院細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的McCoy′s 5A培養(yǎng)基中，飽和濕度，37 ℃，5% CO2孵育箱中，每3天更換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞鋪滿底壁的85%～90%時(shí)，按1∶2傳代，取呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

　　1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

　　取呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔2 500個(gè)細(xì)胞密度接種于4塊96孔板中，過夜貼壁后，加入含有5AzaCdR不同終濃度的培養(yǎng)基，每孔200 μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)不加藥的對(duì)照孔和不接種細(xì)胞的調(diào)零孔。藥物和培養(yǎng)液每24 h更換1次，每天取出1板，加入5 g/L的MTT溶液20 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min充分溶解結(jié)晶，置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定在波長(zhǎng)490 nm處的光密度值，細(xì)胞生存率以平均光密度值分析，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以平均光密度值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線圖。

　　1.2.3 DNA特異性甲基化PCR(MSP)檢測(cè)CpG島甲基化

　　取用10-6 mol/L的5AzaCdR處理72 h細(xì)胞以及未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組細(xì)胞，按DNA提取試劑盒說明書(大連TaKaRa公司)提取各組DNA，基因組DNA中富含CG區(qū)的異常甲基化首先要經(jīng)過亞硫酸氫鈉化學(xué)修飾作用， 使未甲基化的胞嘧啶(C)變?yōu)槟蜞奏?U)，而已甲基化的胞嘧啶(Cm)則不會(huì)改變。采用甲基化修飾試劑盒(北京天漠科技公司)處理已提取的各樣本DNA。DNA甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)：根據(jù)文獻(xiàn)[5]合成寡核苷酸引物(上海生工生物工程有限公司合成)，引物序列，EcadM，5′TTAGGTTAGAGGGTTATcGCGT3′(正義)，5′TAACTAAAAATTCACCTACCGAC3′(反義)，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度116 bp。PCR反應(yīng)條件，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，57℃退火45 s;72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min;EcadU，5′TAATITTAGGTTAGAGGGTTATTGT3′(正義)，5′CACAACCAATCAACAACACA3 ′(反義)，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度97 bp。反應(yīng)條件，95 ℃預(yù)變性10 min，95度變性30 s，53 ℃退火45 s;72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。EcadM和EcadU分別用于擴(kuò)增Ecad基因CpG島甲基化和非甲基化的等位基因。擴(kuò)增產(chǎn)物于2.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外線凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，根據(jù)DNA條帶判斷結(jié)果。

　　1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)5AzaCdR干預(yù)前后Ecad 蛋白的表達(dá)變化

　　取用10-6 mol/L的 5AzaCdR處理72 h的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組細(xì)胞，嚴(yán)格按照膜提取試劑盒操作說明書(上海貝博膜蛋白提取試劑盒)提取Ecad蛋白，用BCA法對(duì)所提取的蛋白進(jìn)行定量。膜在一抗Ecad單克隆抗體中室溫下孵育2 h，PBS洗滌加二抗室溫下2 h，堿性磷酸酶染色，自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)下成像。

　　1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 不同濃度 5AzaCdR處理后Caki1細(xì)胞的增殖活性

　　MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，時(shí)間不變，5AzaCdR對(duì)Caki1增殖的抑制率隨濃度的增大而增強(qiáng)，且不同濃度組間的抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);濃度不變，5AzaCdR 對(duì)Caki1增殖的抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，且不同作用時(shí)間的組間抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。見圖1。圖1 不同濃度5AzaCdR處理細(xì)胞Caki1的增殖曲線

　　2.2 5AzaCdR對(duì)Caki1細(xì)胞Ecad基因甲基化狀態(tài)的影響

　　未經(jīng)藥物處理的Caki1細(xì)胞中Ecad基因顯示高甲基化，而經(jīng)過藥物處理的也有甲基化條帶的出現(xiàn)，但明顯低于對(duì)照組;經(jīng)5AzaCdR 處理的非甲基化引物擴(kuò)增片段的強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組，表明Ecad基因高甲基化發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。見圖2。M：DNA Ladder 2000;1，2：對(duì)照組非甲基化產(chǎn)物;3，4：實(shí)驗(yàn)組非甲基化產(chǎn)物圖2 甲基化特異性PCR檢測(cè)Ecad基因　　的甲基化狀態(tài)

　　2.3 5AzaCdR對(duì)Caki1細(xì)胞Ecad蛋白表達(dá)的影響

　　蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)顯示，β肌動(dòng)蛋白和Ecad特異性免疫印跡條帶的相對(duì)分子質(zhì)量分別為124 000和43 000，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的β肌動(dòng)蛋白表達(dá)基本一致，而未經(jīng)5AzaCdR處理的對(duì)照組細(xì)胞Ecad蛋白表達(dá)明顯低于經(jīng)過5AzaCdR處理72 h的實(shí)驗(yàn)組的蛋白表達(dá)，說明5AzaCdR可以上調(diào)Ecad蛋白的表達(dá)。見圖3。圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Ecad蛋白的表達(dá)

　　3 討 論

　　浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是腎癌重要的生物學(xué)特征，也是造成臨床上腎癌患者治療失敗的主要原因。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落是腫瘤轉(zhuǎn)移的始動(dòng)環(huán)節(jié)，這一過程與細(xì)胞黏附功能降低密切相關(guān)。Ecad是一類主要介導(dǎo)細(xì)胞間同質(zhì)黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，是細(xì)胞黏附分子中的一種。人類的Ecad編碼基因定位于16號(hào)染色體q22.1附近，由723～748個(gè)氨基酸組成，包括N端胞外區(qū)、高度疏水的跨膜區(qū)及C端胞內(nèi)區(qū)[6]。鈣離子依賴性黏附素分子家族是一類重要的細(xì)胞間黏附分子，其中上皮性鈣離子依賴的黏附素分子Ecad是維持正常上皮細(xì)胞間黏附的重要分子，Ecad表達(dá)降低將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)生長(zhǎng)和由原發(fā)灶脫落轉(zhuǎn)移，是多種腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的主要因素[7]，因此研究腎癌組織中Ecad分子表達(dá)的改變及其機(jī)制對(duì)于了解腎癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制和指導(dǎo)臨床治療可能具有一定的價(jià)值。

　　DNA甲基化在腫瘤相關(guān)基因表達(dá)中具有重要作用，它可以通過基因啟動(dòng)子及其附近區(qū)域內(nèi)CpG島胞嘧啶的甲基化關(guān)閉某種組織或細(xì)胞不必要的基因，使之不表達(dá)或沉默。研究表明，抑癌基因的失活和表達(dá)降低與其啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化狀態(tài)有關(guān)[4，8]，DNA 高甲基化是引起抑癌基因失活的重要方式，是部分堿基對(duì)發(fā)生甲基化修飾，這種異常的甲基化模式是可以逆轉(zhuǎn)的[9]。5AzaCdR是一種特異性甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，在DNA 復(fù)制過程中與DNA分子相結(jié)合，并與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1形成共價(jià)復(fù)合物，抑制該酶的甲基轉(zhuǎn)移活性，而實(shí)現(xiàn)去甲基化功能，恢復(fù)基因的重新表達(dá)，由于5AzaCd可使抑癌基因甲基化的狀態(tài)消失，所以可以應(yīng)用于某些調(diào)節(jié)基因沉默的腫瘤治療[10]。

　　本實(shí)驗(yàn)采用5AzaCdR處理Caki1后，MTT檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，可以看出細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，呈時(shí)間和劑量依賴性。未經(jīng)5AzaCdR處理的Caki1細(xì)胞中Ecad基因啟動(dòng)子區(qū)域顯示為高甲基化狀態(tài)，而經(jīng)5AzaCdR處理后，5AzaCdR基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)，提示5AzaCdR可逆轉(zhuǎn)Ecad基因高甲基化狀態(tài)而抑制Caki1腎細(xì)胞癌細(xì)胞株增殖。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明經(jīng)5AzaCdR處理后，Ecad蛋白表達(dá)也增強(qiáng)。提示Ecad基因啟動(dòng)子CpG島甲基化可能參與腎癌的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移。在國(guó)外，5AzaCdR已經(jīng)用于臨床治療白血病，提示可進(jìn)一步探討Ecad基因甲基化與腎癌的發(fā)病機(jī)制及腎癌進(jìn)展、預(yù)后之間的關(guān)系，為探討腎細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制及尋求臨床治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

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