作者：黃曉菡1，曾文鋌1，朱科倫1，盧鑒財2 作者單位：(1.廣州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科;2.廣州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510120)
【摘要】 目的：觀察“康寧”膠囊(現(xiàn)已改名為丹芪活肝膠囊)對四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝損傷的的保護(hù)作用。方法：取KM小鼠72只，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組、丹芪活肝膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組6組，每組12只。小鼠分別灌胃給藥，1次/d，連續(xù)5 d，末次給藥24 h后，除正常對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射0.05 g/kg的CCl4花生油溶液，24 h后采血，檢測血清ALT、AST活性及觀察肝組織病理學(xué)變化。結(jié)果：丹芪活肝膠囊能降低CCl4所致小鼠肝損傷中血清ALT或AST活性(P<0.01～0.05)。丹芪活肝膠囊高、中、低劑量組均能明顯改善小鼠肝組織損傷的程度。結(jié)論：丹芪活肝膠囊對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與保護(hù)肝細(xì)胞膜、減輕炎性反應(yīng)有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。
【關(guān)鍵詞】 肝損傷;四氯化碳;丹芪活肝膠囊
[ABSTRACT] ob[x]jective： To observe the protective effect of Danqi Huogan Capsule (DHC) on liver injury in mice induced by carbon tetrachloride (CCl4). Methods： 72 KM mice were randomly divided into six groups： normal control group， model group， bifendate group， high dosage group of DHC， medium dosage group of DHC， and low dosage group of DHC. All mice were administered with DHC by intragastric administration (ig)， one time per day for five consecutive days， and 24 hours following the last dosage of administration， the mice in groups except the normal control group were administered with CCl4 (0.05 g/kg) by ip. Blood samples were collected in 24 hours following the ip injection and the levels of ALT， AST activity content in serum were measured， and the pathological change of liver tissue were observed. Results： DHC has lowered the levels of ALT and AST activity significantly in the serum of the mice with liver damage induced by CCl4 (P<0.05， P<0.01). In addition， the pathological sections showed that the liver injury in both high and medium dosage DHC groups has been significantly improved. Conclusions： DHC can protect against liver injury induced by CCl4 in mice. The mechanism may be related to protection of liver cell membrane and reduction of the inflammatory response.
[KEY WORDS] Hepatotoxicity; CCl4， DHC
“康寧”膠囊(現(xiàn)已改名為丹芪活肝膠囊)為我院復(fù)方制劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，主要成份有黃芩、菊花、丹參、山楂、黃芪等，主要藥效是活血化瘀、清熱解毒，在臨床治療慢性肝炎及肝纖維化方面取得了較好的療效[1,2]。組方中各種單味中藥具有抗肝炎藥理活性，但復(fù)方制劑治療肝損傷的基礎(chǔ)研究卻少有研究。本實(shí)驗(yàn)旨在通過建立四氯化碳(CCl4) 急性肝損傷模型對丹芪活肝膠囊的藥效學(xué)及治療機(jī)制進(jìn)行研究，推動其在臨床上的廣泛應(yīng)用。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
取KM小鼠(SPF級)72只，體重17～20 g，雌、雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
1.1.2 主要藥物和試劑
聯(lián)苯雙酯滴丸(廣州星群藥業(yè)股份有限公司)、四氯化碳(CCl4)(廣東光華化學(xué)有限公司)、丹芪活肝膠囊(廣州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，生產(chǎn)批號20081204)。聯(lián)苯雙酯加蒸餾水配成濃度為7.5 mg/mL聯(lián)苯雙酯溶液;丹芪活肝膠囊去殼取藥，加蒸餾水配成濃度分別為66、33、16.5 mg/mL的丹芪活肝膠囊高、中、低劑量溶液。CCl4與花生油混合成0.5%的CCl4花生油溶液。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測試劑和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測試劑購自BECKMAN COULTER。
1.1.3 儀器
自動生化分析儀(BECKMAN SYNCHRON LX20)、離心機(jī)(eppendorf centrifuge 5415D)。
1.2 動物分組及處理
將72只KM小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組(0.15 g/kg)及丹芪活肝膠囊高劑量組(1.32 g/kg)、中劑量組(0.66 g/kg)、低劑量組(0.33 g/kg)共6組，每組12只，雌、雄各半。采用灌胃給藥，各組均給藥5 d,1次/d，正常對照組及模型組給予等量的飲用水作對照。各組小鼠給藥第6天上午一次性腹腔注射CCl4 l0 mL/kg，夜晚禁食不禁水，24 h后摘眼球取血，離心分離血清，-20 ℃冰箱保存待測，用自動生化分析儀測定血清中ALT、AST的活性。取肝臟置10%甲醛溶液固定、石蠟包埋切片、HE染色，光鏡下觀察病理變化。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理
各組數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以(x-±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，如果方差不齊則用Tamhanle′s T檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 丹芪活肝膠囊對CCl4致小鼠急性肝損傷模型血清中ALT、AST的影響
模型組給予CCl4腹腔注射24 h后，血清中ALT、AST含量較正常對照組顯著升高(P<0.01)。丹芪活肝膠囊高、中、低劑量組可以不同程度地降低肝損傷小鼠的ALT、AST含量，其中高劑量、低劑量組對ALT的降低與模型組比較有顯著性差異(P<0.01);各劑量組對AST的降低均有顯著性差異(P<0.05)。聯(lián)苯雙酯組與模型組比較，ALT有顯著性差異(P<0.01)，但AST差異無顯著性(表1)。表1 丹芪活肝膠囊對小鼠CCl4急性肝損傷模型血清 ALT、AST的影響
2.2 丹芪活肝膠囊對CCl4致急性肝損傷模型小鼠的肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響
正常對照組小鼠肝臟體積正常，呈鮮紅色，表面光滑、邊緣整齊，組織切片顯示肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，排列規(guī)律，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索及肝竇清晰，肝細(xì)胞未見水腫及壞死;模型組在CCl4染毒24 h后成功誘導(dǎo)急性肝損傷，可見肝臟組織內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞大片壞死，壞死區(qū)域累及肝小葉大部分或相連的幾個肝小葉，小葉結(jié)構(gòu)不清，殘存的肝細(xì)胞輕度水腫，肝竇受壓;丹芪活肝膠囊高劑量組小鼠肝細(xì)胞有小量炎性細(xì)胞，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，未見水腫和壞死。中劑量組小鼠肝細(xì)胞有小量炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞輕度壞死，結(jié)構(gòu)完整。低劑量組小鼠肝細(xì)胞有炎性細(xì)胞浸潤，空泡變性，有輕度水腫，結(jié)構(gòu)基本完整。與模型組比較，丹芪活肝膠囊不同程度地減少了CCl4誘導(dǎo)的肝損傷中肝細(xì)胞中的炎性細(xì)胞浸潤、水腫、變性、壞死(圖1)。注：(A)正常對照組，(B)模型組，(C)聯(lián)苯雙酯組，(D)丹芪活肝膠囊高劑量組，(E)丹芪活肝膠囊中劑量組，(F)丹芪活肝膠囊低劑量組。圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE×100)
3 討論
CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷動物模型是經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型，在形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)等方面和人肝損傷相似。CCl4進(jìn)入肝細(xì)胞后，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中由細(xì)胞色素P450產(chǎn)生活潑的三氯甲基自由基和氯自由基，與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜的大分子共價結(jié)合，使酶的功能喪失，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，胞漿Ca2+濃度升高，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶滲入血液，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為肝小葉中央?yún)^(qū)壞死和脂肪變性，血清學(xué)指標(biāo)為ALT、AST升高[3,4]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M以腹腔注射CCl4造模后，小鼠血清中AST、ALT水平均比正常對照組明顯升高;病理切片顯示，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)大面積水腫、空泡，大量炎癥細(xì)胞浸潤，并且有細(xì)胞變性、壞死，與其形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)表現(xiàn)相符，造模成功。
丹芪活肝膠囊組方中，黃芪、丹參有抗病毒、抗炎的藥理活性，黃芩、菊花能減少自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，起到保肝作用[6-9]。Sun等[10]也證實(shí)黃芪降低CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷中的血清轉(zhuǎn)氨酶水平、減少脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。另有報道指出[11]，丹參能通過抗氧化和增加P450 2E1蛋白含量從而改善CCl4引起的肝毒性。
實(shí)驗(yàn)中，丹芪活肝膠囊能有效降低肝損傷小鼠血清的ALT或AST水平。肝臟活檢是顯示肝臟實(shí)質(zhì)性損害、炎癥活動、纖維化好的指標(biāo)。病理切片顯示，與模型組比較，丹芪活肝膠囊給藥組小鼠的肝細(xì)胞變性、壞死表現(xiàn)均普遍減輕，并且呈劑量依賴性，進(jìn)一步證實(shí)丹芪活肝膠囊對肝細(xì)胞的保護(hù)作用。
丹芪活肝膠囊的藥效可能通過多種途徑完成：保護(hù)肝細(xì)胞膜的完整性、減輕炎癥反應(yīng);抵抗脂質(zhì)過氧化物對肝細(xì)胞膜的損傷;抗病毒、免疫調(diào)節(jié);改善肝臟局部微循環(huán)等。
初步研究發(fā)現(xiàn)，丹芪活肝膠囊保護(hù)CCl4所致急性肝損傷，明顯降低轉(zhuǎn)氨酶，改善受損肝臟的組織學(xué)形態(tài)，其作用機(jī)制尚不完全清楚。今后將研究丹芪活肝膠囊在肝細(xì)胞損傷的脂質(zhì)過氧化、血流動力學(xué)、免疫學(xué)等方面的保護(hù)機(jī)制，推動其更廣泛的臨床應(yīng)用。
