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氨茶堿對哮喘呼吸道重塑大鼠支氣管組織中Bcl2及Bax蛋白含量的影響

文章來源:創(chuàng)新醫(yī)學(xué)網(wǎng)發(fā)布日期:2012-02-04瀏覽次數(shù):40719

段旭東,趙輝,王曉紅,于文濤,王曉媛  作者單位:河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中醫(yī)外科,河北 石家莊 050000

  【摘要】目的 觀察氨茶堿對支氣管哮喘呼吸道重塑大鼠呼吸道形態(tài)學(xué)及氣管周圍組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl2及Bax含量的影響。方法 SD大鼠隨機分為正常組、模型組、治療組,每組8只,除正常組外以卵蛋白致敏并吸入激發(fā)法制備大鼠哮喘模型,治療組、模型組從第1次哮喘激發(fā)開始(造模第15天)分別給予氨茶堿0.035 g•kg-1•d-1、生理鹽水2 ml/d灌胃給藥,用藥4 w后處死大鼠,取肺組織HE染色,病理圖像分析儀測量支氣管壁面積、支氣管平滑肌面積,采用免疫組化法測定支氣管上皮及支氣管壁周圍組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl2及Bax含量。結(jié)果 與正常組比較,模型組大鼠支氣管壁面積、平滑肌面積明顯增加(t=5.13,P=0.00,t=2.85,P=0.00),支氣管上皮中凋亡相關(guān)蛋白Bcl2及支氣管壁周圍組織中Bax含量均明顯增加(t=52.4,P=0.00,t=61.0,P=0.00),治療組大鼠支氣管壁面積、平滑肌面積較模型組顯著降低(t=2.77,P=0.00,t=1.26,P=0.01),支氣管上皮中Bcl2含量及支氣管周圍組織中Bax含量均顯著增加(t=28,P=0.009,t=36.5,P=0.01)。結(jié)論 氨茶堿可通過提高支氣管上皮中Bcl2及支氣管周圍組織中Bax含量抑制哮喘大鼠氣管壁、平滑肌增厚,從而抑制支氣管哮喘大鼠氣管重塑。

  【關(guān)鍵詞】 氨茶堿;支氣管哮喘;氣道重塑;Bcl2;Bax

  支氣管哮喘氣管重塑是其主要臨床特征之一,是導(dǎo)致呼吸道高反應(yīng)性及肺功能持續(xù)性、進行性損傷的主要原因,并可能導(dǎo)致頑固性哮喘〔1〕。氨茶堿作為治療支氣管哮喘的經(jīng)典藥物臨床應(yīng)用廣泛,其藥理研究多集中于抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用,對氣道重塑的影響尚未見報道。本實驗擬通過探討氨茶堿對支氣管哮喘大鼠支氣管組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、Bax含量的影響,進一步探討氨茶堿對支氣管哮喘氣管重塑的防治作用。

  1 材料與方法

  1.1 實驗動物

  清潔級SD大鼠24只,雌雄各半,體重180~220 g,由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供,動物合格證號:SCXK(鄂) 2004007。室溫20℃飼養(yǎng),自由進食水。

  1.2 藥物

  氨茶堿,天津金耀氨基酸有限公司產(chǎn)品,批準文號:國藥準字H12020978。批號:20050917,250 mg,10 ml/支。

  1.3 主要儀器及試劑

  彩云JWC201D超聲霧化器:鞍山市同信醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品。卵蛋白:美國Sigma公司產(chǎn)品。氫氧化鋁:天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn),分析純。NDY1000彩色病理圖像分析儀:武漢同濟醫(yī)科大學(xué)千屏影像科技公司生產(chǎn)。BH2光學(xué)顯微鏡:Olympus公司生產(chǎn)。

  1.4 動物分組及給藥

  實驗大鼠按隨機表分為正常組、模型組、氨茶堿治療組(簡稱治療組),每組8只。治療組從第1次哮喘激發(fā)開始灌胃給藥,直至處死,2 ml每日1次,用藥劑量按有關(guān)公式〔2〕,將人臨床用藥劑量折算為大鼠用藥劑量,模型組、正常組均以2 ml生理鹽水代替氨茶堿,每日1次灌胃。

  1.5 模型建立

  實驗組參照〔3〕,分別于第1天及第8天大鼠腹腔內(nèi)注射新鮮配制的卵蛋白溶液1 ml(內(nèi)含卵蛋白100 mg,氫氧化鋁100 mg)致敏,第15天起哮喘模型組、治療組開始霧化吸入1%卵蛋白激發(fā)哮喘,霧化流量5 ml/min,隔日1次,每次20 min,共4 w,以大鼠出現(xiàn)呼吸加快,口唇發(fā)紺,腹肌痙攣,點頭呼吸及站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為激發(fā)成功。正常組以生理鹽水代替卵蛋白進行腹腔注射及霧化吸入。

  1.6 檢測指標及方法

  1.6.1 病理組織學(xué)觀察

  10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉,麻醉完全后開胸,迅速結(jié)扎右主支氣管,取右肺中葉,4℃ 4%多聚甲醛固定,脫水、包埋、切片。HE染色,鏡下觀察病理學(xué)改變。采用NDY1000型圖像分析儀測量大鼠氣道壁面積、支氣管平滑肌的面積,用完整支氣管管腔的內(nèi)周長(Pi)進行標準化。

  1.6.2 支氣管上皮及其周圍組織中Bcl2、Bax含量測定

  石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度酒精脫水,磷酸緩沖液(PBS)漂洗5 min×2次;3%的雙氧水甲醇溶液室溫孵育5~10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS洗滌3次;將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0),微波爐加熱至沸騰后斷電,間隔5~10 min,反復(fù)1~2次,冷卻后PBS洗滌2次,滴加5%正常山羊血清封閉,室溫孵育20 min。傾去多余液體,滴加Bcl2和BaxⅠ抗(1∶100稀釋)濕盒孵育,4℃冰箱內(nèi)過夜,PBS洗滌5 min× 2次;滴加生物素標記的二抗工作液,37℃孵育45 min,PBS 洗滌5 min×2次;滴加試劑過氧化物酶(SABC)(1∶100稀釋),37℃孵育20 min,PBS洗滌5 min×2次;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5~15 min,終止呈色反應(yīng);蘇木素襯染,常規(guī)裱片、干燥、脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下,Bcl2和Bax蛋白染色呈棕黃色顆粒。Bcl2蛋白測定:每張切片高倍鏡下(×400)由同一觀察者選取支氣管上皮四周及左上共5個視野,計算機圖像處理軟件半定量測定支氣管Bcl2含量(以染色吸光度值表示)。Bax蛋白測定:每張切片高倍鏡下(×400)由同一觀察者選取支氣管壁四周及左上共5個視野,計算機圖像處理軟件半定量測定支氣管Bcl2含量(以染色吸光度值表示)。

  1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

  數(shù)據(jù)采用x±s表示,用Stata8.0統(tǒng)計軟件處理,統(tǒng)計方法采用單因素方差分析及t檢驗。

  2 結(jié) 果

  2.1 支氣管面積、支氣管平滑肌面積的變化

  與正常組相比,哮喘激發(fā)4 w后模型組大鼠支氣管壁面積、平滑肌面積明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.13,P=0.00,t=2.85,P=0.00)),治療組大鼠支氣管壁面積、平滑肌面積明顯低于模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.77,P=0.00,t=1.26,P=0.01)。見表1,圖1。表1 各組大鼠氣道形態(tài)學(xué)的比較 (略)

  2.2 Bcl2、Bax蛋白含量的變化

  與正常組相比,哮喘激發(fā)4 w后,模型組大鼠支氣管肺組織中Bcl2、Bax蛋白含量明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=52.4,P=0.00,t=61.0,P=0.00)。與模型組相比,治療組大鼠支氣管上皮中凋亡相關(guān)蛋白Bcl2含量明顯高于模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=28,P=0.009),支氣管周圍組織中Bax含量高于模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=36.5,P=0.01)。見表2,圖2。表2 氣道重塑大鼠肺組織中Bcl2、Bax含量的變化(略)

  3 討 論

  哮喘氣管重塑本質(zhì)上是機體對氣管上皮慢性損害不完全修復(fù)的結(jié)果,Lee〔4〕等研究表明,上皮細胞損傷可誘發(fā)單核細胞浸潤、上皮下組織纖維化,成纖維細胞和肌細胞的增殖等一系列致纖維化的反應(yīng)。此過程涉及嗜酸性粒細胞、支氣管上皮細胞、平滑肌細胞等多種因素參與,變態(tài)反應(yīng)性炎癥所導(dǎo)致的微環(huán)境改變可以導(dǎo)致氣管多種細胞DNA合成增加以及細胞增生,從而導(dǎo)致氣管重塑,減少支氣管上皮細胞損傷,減少支氣管內(nèi)及周圍炎癥細胞及平滑肌細胞的數(shù)量可有效地抑制氣道重塑〔5〕。近年的研究表明細胞的凋亡受多種基因的調(diào)控,其中Bcl2,Bax被認為是抑制及促進細胞凋亡重要的調(diào)控基因。

  本研究結(jié)果提示哮喘氣道重塑過程中由于氣道炎癥導(dǎo)致氣道上皮損傷,機體通過提高支氣管上皮中Bcl2含量從而抑制上皮細胞凋亡以對抗氣道重塑;治療組氣道上皮細胞具有更好的抗凋亡能力,氣道上皮的完整可防止由氣道上皮損傷引起的氣道重塑〔4〕。

  Bax基因位于19q13.313.4,由6個外顯子組成,是重要的促凋亡基因,當Bax大量表達時,細胞對凋亡信號的反應(yīng)增強,細胞凋亡增多,因此Bax被稱為“死亡激動劑”。

  本實驗提示正常情況下氣道壁肺組織細胞凋亡數(shù)量少,提示機體在氣道重塑過程中通過加速氣道壁肺組織細胞(包括氣道上皮基底膜細胞、平滑肌細胞及氣道周圍組織細胞)凋亡以抑制氣道重塑。與模型組相比,治療組支氣管壁面積、支氣管平滑肌面積均明顯降低而Bax含量升高明顯,提示治療組較高的支氣管壁肺組織細胞凋亡可抑制氣道重塑。

  應(yīng)用氨茶堿治療哮喘已有80多年的歷史,口服或直腸給藥吸收迅速,有效血藥濃度為10~20 mg/L,理論上給予0.5 mg/kg氨茶堿可使血清藥物濃度上升1 mg/L,其治療劑量與中毒劑量十分接近,20 mg/L血藥濃度即可出現(xiàn)中毒反應(yīng),血清藥物濃度大于35 mg/l時可引起呼吸急促、驚厥甚至死亡〔6〕。本實驗中原設(shè)置的高劑量氨茶堿(70 mg/kg)組實驗動物,用藥后呼吸興奮、驚厥等中毒反應(yīng)明顯,并有數(shù)只在實驗過程中死亡,無法進行統(tǒng)計處理。

  綜上所述,氨茶堿具有較好的抑制支氣管哮喘氣道重塑的作用,其作用提高支氣管上皮及支氣管壁肺組織中Bcl2、Bax含量,減少氣道上皮細胞的損傷,促進支氣管壁肺組織細胞凋亡的作用相關(guān)。