四種基因甲基化特異性PCR引物設(shè)計(jì)探討

【摘要】  目的： 對甲基化特異性PCR(methylationspecific PCR，MSP)引物設(shè)計(jì)進(jìn)行探討。方法： 使用Methyl Primer Express Software Version 1.0軟件、“methprimer”和“MSPprimer”的網(wǎng)上在線軟件設(shè)計(jì)的引物以及參照國外文獻(xiàn)的MSP引物對CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白ζ（CEBPζ），CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ（CEBPδ）、脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）和死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK）基因啟動子進(jìn)行MSP擴(kuò)增，然后對其MSP產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證以比較MSP引物設(shè)計(jì)的可靠性。結(jié)果： 對于CEBPζ，CEBPδ，F(xiàn)HIT和DAPK啟動子基因所設(shè)計(jì)的MSP引物經(jīng)MSP后均獲得了所需要的目的條帶，但經(jīng)測序鑒定Methyl Primer Express和methprimer設(shè)計(jì)的CEBPδ，CEBPζ1的MSP擴(kuò)增產(chǎn)物為假陽性產(chǎn)物，而MSPprimer設(shè)計(jì)的CEBPζ2的MSP產(chǎn)物為正確序列。結(jié)論： MSP引物設(shè)計(jì)的質(zhì)量是保證MSP擴(kuò)增成功的關(guān)鍵因素。
【關(guān)鍵詞】  甲基化特異性PCR； 引物； 設(shè)計(jì)
　?。跘bstract］ob[x]jective: To study the primer design of methylationspecific PCR(MSP).Methods： The Primer of MSP was designed using the software of Methyl Primer Express Software Version 1.0,the online software of “methprimer” and “MSPprimer”to amplify CEBPζ, CEBPδ, FHIT and DAPK gene promoters.The MSP assay was established to detect the methylation status of these promoters.Then the MSP products were analyzed in electrophoresis and sequenced. Results： The expected bands were all obtained for all five primer sets.But sequencing revealed that amplification products using CEBPζ1 and CEBPδ primers designed with Methyl Primer Express Software and methprimer were false positive, amplification products using CEBPζ2 primers designed with MSPprimer, FHIT and DAPK primers were correct.  Conclusion： Quality of designed primers was the vital factor for the successful of amplification of MSP.
　　［Key words］methylationspecific PCR； primer； design
    DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式之一，在X染色體失活、基因組印記、DNA修復(fù)和基因表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮著重要的作用［1］。DNA甲基化主要是指在CpG二核苷酸中胞嘧啶環(huán)的第5位碳原子上以共價(jià)鍵的形式結(jié)合上一個(gè)甲基基團(tuán)，形成5甲基胞嘧啶（5mC），而基因組的某些特定區(qū)域由于富集CpG寡核苷酸則形成了CpG島（CpG island，CGI）。約50％～70％的人類基因啟動子區(qū)含有CGI，而在胚胎形成及正常組織中多數(shù)CGI是低甲基化的，但在正常組織細(xì)胞的定向分化過程中一些關(guān)鍵基因的甲基化可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［2］，而在腫瘤細(xì)胞的演變過程中一些抑癌基因則發(fā)生了高甲基化（hypermethylation）并導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄活性改變，這些改變已被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］。
    目前甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylationspecific PCR,MSP)已被廣泛用來研究啟動子的甲基化狀態(tài)。然而，MSP擴(kuò)增常會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，導(dǎo)致國際上報(bào)道同一基因在同一種腫瘤中異常甲基化的發(fā)生率差異極大［4］。因此我們針對MSP的引物作了一些探討性研究。
    1  方 法
    1.1 DNA提取與修飾 
    取胎盤組織DNA標(biāo)本1 μg/100  μl，按CpGenomeTM DNA修飾試劑盒（Chemicon公司，加拿大）說明書進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，經(jīng)甲基化酶M.SssI處理后再修飾和不經(jīng)過M.SssI處理直接修飾的DNA分別作為甲基化和未甲基化的陽性模版。
   
　　1.2 MSP檢測
    選擇4個(gè)基因：CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白ζ（CEBPζ） 啟動子序列(NCBI序列號NM_004083)；CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ（CEBPδ）啟動子序列(NCBI序列號NM_005195)；脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）啟動子序列（NCBI序列號NM_002012）；死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK）啟動子序列（NCBI序列號X76104）。應(yīng)用Methyl Primer Express Software Version 1.0（ABI公司）設(shè)計(jì)CEBPδ的MSP引物；應(yīng)用“methprimer”（http://www.urogene.org/methprimer/）和“MSPprimer”（http:∥www.mspprimer.org/cgimspprimer/design.cgi）網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)CEBPζ的MSP引物（CEBPζ1和CEBPζ2）；FHIT，DAPK的MSP引物參照國外文獻(xiàn)設(shè)計(jì)［5,6］，序列見表1。表1  相關(guān)基因的引物序列及退火溫度（略）
　　MSP反應(yīng)條件均經(jīng)優(yōu)化，其中CEBPζ，CEBPδ和DAPK反應(yīng)條件為95℃ 5 min, 然后94℃ 45 s，退火溫度（表1）45 s，72℃延伸45 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán), 72℃延伸7 min；FHIT為95℃ 10 min, 然后94℃ 45 s，退火溫度45 s，72℃延伸45 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán), 72℃延伸7 min。以去離子水作為陰性對照。
    1.3 MSP產(chǎn)物克隆測序 
    將PCR擴(kuò)增的甲基化和未甲基化產(chǎn)物克隆入pGEMT載體中，送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司克隆測序。
    2 結(jié) 果
    5對MSP擴(kuò)增產(chǎn)物均在預(yù)期位置出現(xiàn)了目的條帶（圖1），去離子水均為陰性。但經(jīng)過測序鑒定發(fā)現(xiàn)CEBPδ和CEBPζ1的MSP甲基化產(chǎn)物為非特異性擴(kuò)增，而CEBPζ2，F(xiàn)HIT和DAPK的MSP甲基化產(chǎn)物則是正確的擴(kuò)增序列（圖2）。
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3 討 論
    由于DNA甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，一些研究已開始嘗試將之用于多發(fā)性骨髓瘤、腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等的早期檢測和診斷［7-11］。MSP以其特異、簡便、經(jīng)濟(jì)、快速等特點(diǎn)，已經(jīng)在DNA甲基化檢測中得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)將DNA先用重亞硫酸鹽處理，這樣未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的不變，針對修飾前后的序列差異用特異性軟件設(shè)計(jì)甲基化與未甲基引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MSP引物設(shè)計(jì)中容易出現(xiàn)下列問題：①不能擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸鹽修飾的DNA；②可能同時(shí)擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸鹽修飾和未經(jīng)亞硫酸鹽修飾的DNA；③未甲基化引物擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸鹽修飾的DNA未能獲得正確的未甲基化產(chǎn)物；④甲基化引物擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸鹽修飾的DNA未能獲得正確的甲基化產(chǎn)物。
    因此MSP引物設(shè)計(jì)必須考慮到以下幾個(gè)方面：①M(fèi)SP引物要能區(qū)分亞硫酸鹽修飾前后的DNA序列，以避免擴(kuò)增處理不完全的DNA；②引物必須包含幾個(gè)CpG島以區(qū)別甲基化和未甲基化的DNA，以避免甲基化引物擴(kuò)增未甲基化模版；③產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物的引物必須要剔除，因?yàn)楸惶蕹囊锶菀桩a(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)或二聚體，降低擴(kuò)增效率；④導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的引物必須排除［4］。
    我們發(fā)現(xiàn)CEBPδ和CEBPζ啟動子存在著甲基化島，擬對白血病患者中的甲基化態(tài)勢進(jìn)行研究。為了確定MSP的特異性，我們設(shè)計(jì)了CEBPδ和CEBPζ啟動子甲基化島的MSP引物，并選擇了目前報(bào)道在腫瘤中甲基化發(fā)生率較高的2個(gè)基因FHIT和DAPK進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明Methyl Primer Express軟件和MetyPrimer在線軟件未能充分考慮到甲基化PCR的特異性和重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變的充分性，設(shè)計(jì)的引物上包含的CG數(shù)量僅為2個(gè)，難以區(qū)分甲基化產(chǎn)物和未甲基化產(chǎn)物，容易產(chǎn)生假陽性PCR產(chǎn)物；而MSPprimer在線軟件所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增序列正確，該軟件對亞硫酸鹽處理前后序列、甲基化和未甲基化序列的自由能差異考慮得更為充分，且引物序列上一般至少含有3個(gè)CG，因而特異性更好。由于要擴(kuò)增的DNA序列中CG含量相對較高，MSP擴(kuò)增難度較大，因此設(shè)計(jì)好的引物好應(yīng)用引物軟件Primer 5.0對引物二聚體、非特異性擴(kuò)增進(jìn)行評價(jià)，并從理論上預(yù)測其引物退火溫度（Tm值），從而選擇佳引物對。如果退火溫度過低則可能引起甲基化引物對未甲基化模板的非特異性擴(kuò)增。一般來說一對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)，引物間的熔融溫度Tm的差異不超過2℃，若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5′端加適量的A，T或G，C尾巴。而對于擴(kuò)增效率<30％的引物要進(jìn)行優(yōu)化［12］，其方法是:在核心啟動子區(qū)域前后反復(fù)調(diào)整甲基化前導(dǎo)引物擴(kuò)增起始點(diǎn),以期使引物擴(kuò)增效率增高，降低擴(kuò)增難度，從而提高PCR產(chǎn)量。MSP產(chǎn)物終仍需測序以評價(jià)引物擴(kuò)增的保真性。
    總之，一般來說參照國外文獻(xiàn)的引物進(jìn)行研究甲基化的抑癌基因可能少走彎路，但是由于國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室條件的不同，好自行設(shè)計(jì)引物。我們已經(jīng)證明未按如上的要求很容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果，這個(gè)假陽性的結(jié)果可能由于未設(shè)計(jì)好特異性的引物和未找到合適的退火溫度造成的。
   
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