液體雙試劑測定血氨在全自動生化儀上的運用

【摘要】 目的 在全自動生化儀上建立液體雙試劑連續(xù)監(jiān)測法測定血氨。方法 用連續(xù)監(jiān)測法對pH、谷氨酸脫氫酶濃度等反應條件進行實驗研究，并進行方法學評價。結(jié)果 雙試劑連續(xù)監(jiān)測方法，試劑Ⅰ：含三乙醇胺緩沖液（pH7.4）0.25mol/L，α-酮戊二酸15mol/L，NADH 0.3mmol/L；試劑Ⅱ：含谷氨酸脫氫酶≥160u/L。線性范圍達321μmol/L，批內(nèi)Cv=3.4%，批間Cv=8.7%。參考值范圍（±2SD）：10.5～44.1μmol/L。結(jié)論 本方法操作簡便，結(jié)果準確，方法合理，符合全自動條件，可推廣使用。

【關(guān)鍵詞】 血氨；液體雙試劑；全自動生化分析儀

　　血氨主要來自腸道內(nèi)腸菌酶類對未消化吸收的蛋白質(zhì)氨基酸的腐敗作用，以及對尿素分解產(chǎn)生的氨。血氨的測定方法有許多種，如擴散法、去蛋白波氏比色法、離子交換層析法、氨電極法、酶法、干化學法等［1］。但擴散法及波氏比色法靈敏度低，準確性及精密度不佳；離子交換層析法需長時間處理；氨電極法準確度和精密度較好，但穩(wěn)定性受多種因素影響，尚難普及使用；干試劑酶法可用在半自動生化儀上，但手工操作過程干擾因素多，且干粉試劑溶解后有效期短，難以控制測試的準確度和精密度，加上血氨測定樣本少，使測試成本增高。因此，尋找一種更準確、靈敏、簡便、經(jīng)濟的測定血氨的方法具有實際意義，筆者擬在全自動生化儀上建立液體雙試劑連續(xù)監(jiān)測法測定血氨，結(jié)果準確，現(xiàn)報告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 儀器 美國貝克曼庫爾特公司CX5-CE型全自動生化分析儀。

　　1.2 試劑 ①試劑Ⅰ：裝載量100ml，其中含三乙醇胺緩沖液0.25mol/L，α-酮戊二酸15mol/L，NADH 0.3mmol/L，ADP 1.5mmol/L，pH為7.4，2～8℃下穩(wěn)定半年。②試劑Ⅱ：裝載量15ml，含谷氨酸脫氫酶（GLDH） ≥160u/L，2～8℃下穩(wěn)定1個月。

　　1.3 原理

　　NH+4+α-酮戊二酸+NADHGLDH L-谷氨酸+NAD++H2O

　　NADH消耗速率與NH+4濃度成正比，在340nm處連續(xù)監(jiān)測吸光度的變化率（△A/min）。

　　1.4 方法 ①液體雙試劑連續(xù)監(jiān)測法，試劑Ⅰ200μl，樣本30μl，試劑Ⅱ50μl，先加入試劑Ⅰ，320s后加入樣本，第440s加入試劑Ⅱ。②讀空白時間：開始280s，結(jié)束300s。③反應時間：開始500s，結(jié)束560s。④反應溫度：37℃。⑤波長：主波長340nm，副波長410nm。⑥計算公式：

　　NH+4μmol/L=△A/min280×106 6220×30×0.5

　　2 實驗結(jié)果

　　2.1 適pH 實驗溶液的終pH范圍為7.0～7.8（用日本拜爾公司850血氣分析儀檢測），其它條件（溫度、時間、酶含量和底物濃度）相同，對一份血漿樣本進行血氨檢測，結(jié)果見表1。表明實驗溶液pH越接近7.4，測定值反映越真實。

　　表1 適pH、GLDH濃度觀察（略）

　　2.2 GLDH用量選擇 試劑Ⅱ中GLDH的活性濃度分別為80，120，160，200，240u/L，其他條件不變，測定一份血漿樣本的血氨濃度來觀察GLDH濃度，結(jié)果顯示試劑Ⅱ中GLDH的活性為160u/L時反應曲線已趨平坦，故確定試劑Ⅱ中GLDH的活性濃度為160u/L。見表1。

　　2.3 反應進程 試劑Ⅰ200μl，樣本30μl，混合，37℃孵育2min，加入試劑Ⅱ40μl，340nm連續(xù)監(jiān)測5min，儀器每間隔16s讀1次吸光度值，根據(jù)結(jié)果顯示在1～3min之間呈線性，因此，設定延遲時間為1min，測定時間1min。

　　2.4 試劑的穩(wěn)定性 裝機試劑每日對一份血氨標準液（濃度為55.5μmol/L，北京中生公司產(chǎn)品）進行測定一次，當測定結(jié)果偏離標準值5%時，對試劑Ⅰ、Ⅱ分別更換重測，若結(jié)果能得到糾正即為該試劑的有效期，結(jié)果本法試劑Ⅰ、Ⅱ有效期分別為：試劑Ⅰ半年，試劑Ⅱ1個月。

　　2.5 線性實驗 使用混合病人血漿制備5個水平濃度樣本，制備混合血漿準備如下［2］：低濃度χ1混合血漿，高濃度χ5混合血漿；血漿χ2=3份“χ1”+1份“χ5”；血漿χ3：2份“χ1”+2份“χ5”；血漿χ4=1份“χ1”+3份“χ5”。配制的標本濃度按公式

　標本濃度=X1×V1+X5×V5 V1+V5

　　計算，在同一工作日內(nèi)完成測定工作，每個濃度標本重復測定4次，計算平均值，記錄結(jié)果。通過判斷離群點，結(jié)果顯示，血氨線性可達321μmol/L，=3.465X+0.98，r=0.9997。

　　2.6 精密度試驗 取一份血漿樣本分別作批內(nèi)、批間測定20次，批內(nèi)=38.5μmol/L，S=1.22，Cv=3.4%，批間：=36.7，S=3.21，Cv=8.7%。

　　2.7 參考值 取健康人清晨空腹血樣60例，男女各半，采用肝素鋰抗凝劑，年齡在14～45歲之間，用本方法測定血氨水平，以±2SD為參考范圍。結(jié)果男女差異無顯著性，參考值為：10.5～44.1μmol/L。

　　3 討論

　　3.1 從表1中可看出，pH越接近7.4，測定值越能反映樣本中真實血氨的濃度，偏離7.4，結(jié)果偏低。主要原因是血液中游離氨以NH+4和NH3兩種形式存在，是兩種形式的總量，是兩種形式處于平衡狀態(tài)。在pH 7.4時，98%以NH+4形式存在，因此，維持試劑溶液的pH為7.4，保證了血氨測試的準確性及穩(wěn)定性。

　　3.2 抽樣時應用肝素抗凝劑，不宜用枸櫞酸鈉抗凝劑，因為枸櫞酸鈉抗凝劑分解出H+離子，從而使血氨測定值偏高。我們對20例病人用兩種不同抗凝劑（一種是肝素鋰，一種是枸櫞酸鈉）進行抽樣，離心10min，轉(zhuǎn)速3000 r/min，同時測定血氨濃度，結(jié)果顯示，枸櫞酸鈉抗凝管的血氨濃度平均偏高82個u。

　　3.3 目前使用的血氨干粉酶法試劑盒的參數(shù)不符合全自動生化分析儀條件要求［2］，用半自動生化分析儀進行分析干擾因素太多，加樣器、試管、溶劑等因素都對血氨結(jié)果產(chǎn)生正干擾。且干粉試劑溶解后使用有效期短。為克服此缺點，使血氨試驗真正適合全自動分析，我們對試劑配方進行研究發(fā)現(xiàn)，血氨測試是否準確，試劑Ⅱ中GLDH酶活力的穩(wěn)定十分關(guān)鍵，使用雙試劑，分開保存NADH和GLDH，用50%甘油配制試劑Ⅱ，同時在試劑Ⅱ中加入一些EDTA-Na，防止金屬離子的干擾，測試時試劑臨時混合，有效提高試劑的有效期，完全符合全自動生化儀的參數(shù)設置。

　　3.4 在測試過程中，交叉污染及環(huán)境等因素會影響試劑中酶的活力，加上標本測試較少，因此，上機試劑裝載量不宜配制過多［3］，以本科室工作量適當配制，同時做好室內(nèi)質(zhì)量控制，發(fā)現(xiàn)失控時即可更換試劑，保證結(jié)果的可靠性。

【參考文獻】
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