實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的視神經(jīng)病理改變

作者：朱瀟穎，趙永波，劉文文，凌振芬

作者單位：200080上海交通大學(xué)附屬人民醫(yī)院神經(jīng)科

【摘要】  　　目的 研究實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的視神經(jīng)病理改變。方法 足墊皮下注射豚鼠脊髓勻漿和完全弗氏佐劑（CFA）混合物制作Wistar大鼠EAE模型，于發(fā)病后第6 d將大鼠處死，取視神經(jīng)、腦和脊髓，行HE和LFB染色，光鏡和電鏡下觀察其病理改變。結(jié)果 病理檢查發(fā)現(xiàn)EAE模型組大鼠腦、脊髓有不同程度的炎癥反應(yīng)和脫髓鞘改變;均有視神經(jīng)病變，光鏡主要表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)和脫髓鞘，視神經(jīng)髓鞘脫失重于炎癥反應(yīng)；電鏡主要表現(xiàn)為髓鞘稀疏，少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少、胞核固縮，其周圍包裹的髓鞘板層松解，軸突髓鞘分離。 結(jié)論 EAE大鼠存在明顯的視神經(jīng)病變，主要為視神經(jīng)炎癥反應(yīng)和脫髓鞘改變。

【關(guān)鍵詞】  實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 視神經(jīng) 脫髓鞘

　　Pathological changes of optic nerves in experimental autoimmune encephalomyelitis 

　　ZHU Xiaoying, ZHAO Yongbo, LIU Wenwen, et al.

　　Department of Neurology, the First Peoples Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China
   
　　Abstract：ob[x]jective  To explore pathological changes of optic nerve  in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Methods  Established the Wistar rat models of EAE by footpad injection of guinea pig spinal cord homogenates and CFA. Animals were executed 6 days after disease onset, and optic nerves, brains and spinal cords were removed for light (HE staining and LFB staining) and electron microscope pathological analysis. Results  Various degrees of inflammation and demyelination of brains and spinal cords were found in the rats of EAE group. All the EAE rats had optic neuropathy mainly manifested as inflammation and demyelination under light microscope. Demyelination changes were more apparente than inflammation in optic nerves. Electron microscope observes decreased number of myelin sheaths and Oligodendrocytes (OLGs), OLGs karyopycnosis and the loosed myelin sheaths and their disassociation from axons were also found nearby. Conclusions  Optic neuropathy is obvious in this rat model of EAE, mainly manifested as optic inflammation and demyelination.
   
　　Key words：experimental autoimmune encephalomyelitis; optic nerve;demyelination

　　實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）是研究人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）炎癥性脫髓鞘疾病的常用動(dòng)物模型。關(guān)于EAE動(dòng)物模型的視神經(jīng)病變的系統(tǒng)研究較少，國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究通過光鏡和電鏡觀察EAE模型大鼠視神經(jīng)的病理改變，為進(jìn)一步研究CNS脫髓鞘疾病合并的視神經(jīng)病變提供病理資料。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料  雌性Wistar大鼠20只，質(zhì)量(200±20)g，SPF級(jí)；隨機(jī)分為對(duì)照組和EAE模型組。豚鼠5只，雌雄不限，質(zhì)量350～400 g，普通級(jí)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由上海市人民醫(yī)院動(dòng)物房提供。

　　1.2  方法

　　1.2.1  EAE模型制作  取豚鼠新鮮脊髓加完全弗氏佐劑（CFA, Sigma公司）充分乳化后按0.5 ml/只,大鼠腳墊皮下注射，同時(shí)及48 h后給大鼠足背皮下注射(0.2 ml/只)百日咳桿菌（1×1010個(gè)/ml，上海生物制品研究所）。對(duì)照組大鼠同時(shí)注射等量生理鹽水加CFA及百日咳桿菌。注射部位皮膚常規(guī)消毒。注射豚鼠脊髓勻漿＋CFA當(dāng)天記為免疫后第0 d。

　　1.2.2  臨床評(píng)分  大鼠免疫后每日由兩名觀察者盲法觀察大鼠一般情況,稱重及臨床評(píng)分。臨床評(píng)分采用常見的5分評(píng)定法［1］，0分：無異常；1分：尾巴失去活動(dòng)與挺立功能；2分：后肢無力；3分：后肢癱瘓；4分：四肢癱瘓；5分：死亡。

　　1.2.3  病理學(xué)觀察  EAE模型組大鼠于發(fā)病后第6 d（發(fā)病當(dāng)日為第0 d）取材，其余大鼠（包括未發(fā)病的EAE模型組大鼠和對(duì)照組大鼠）在免疫后第24 d取材。用10％水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，行心臟灌注（先生理鹽水，后4％多聚甲醛）后取出大鼠腦、脊髓、視神經(jīng)、坐骨神經(jīng)等放入4％多聚甲醛中固定；常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋和切片,HE和LFB焦油紫髓鞘染色，光鏡下觀察。并隨機(jī)選擇發(fā)病的EAE模型組大鼠和對(duì)照組大鼠各1只，取其視神經(jīng)近中樞段約1 mm3組織，立即投入2.5%戊二醛中固定，按常規(guī)電鏡技術(shù)制備半薄切片和超薄切片電鏡下觀察。

　　2  結(jié)果

　　2.1  臨床評(píng)分  對(duì)照組大鼠無發(fā)病。EAE模型組大鼠9只（分別在免疫后第10～18 d）發(fā)?。?0％），平均（13.9±2.6）d發(fā)?。慌R床評(píng)分1～4分，平均（2.0±1.4）分；1只未發(fā)病，臨床評(píng)分為0分，無任何異常表現(xiàn)。

　　2.2  腦、脊髓病理改變  見圖1。對(duì)照組大鼠腦、脊髓組織病理學(xué)檢查未見異常。EAE模型組大鼠腦、脊髓的主要病理學(xué)表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失。HE染色見脊髓灰白質(zhì)交界處、灰質(zhì)、白質(zhì)、脊膜、前正中裂、中央管周圍、后正中溝炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以灰白質(zhì)交接處為明顯。炎性浸潤(rùn)在血管周圍形成“軸套”，在腦、脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)也有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。脊髓、腦干炎癥表現(xiàn)程度明顯重于大腦和小腦。大腦和小腦的炎癥反應(yīng)主要位于腦室周圍和腦膜。LFB焦油紫染色示髓鞘脫失位于脊髓、腦干（主要位于近灰質(zhì)的白質(zhì)、后索和側(cè)索）和大腦（主要位于白質(zhì)深部），部分標(biāo)本脊髓神經(jīng)根處也有脫髓鞘。大多數(shù)脫髓鞘病灶位于炎癥反應(yīng)周圍，呈“花環(huán)樣”圍繞血管周圍分布，嚴(yán)重者脫髓鞘病灶相互融合呈片狀分布，高倍鏡下見炎癥區(qū)域髓鞘大多崩解消失。大鼠組織病理學(xué)異常程度基本同臨床評(píng)分呈正比。另外，周圍神經(jīng)如馬尾、坐骨神經(jīng)和脊神經(jīng)根的包膜和神經(jīng)纖維間有單個(gè)核細(xì)胞的浸潤(rùn)。

　　2.3  視神經(jīng)病理改變

　　2.3.1  光鏡  見圖2。EAE模型組9只發(fā)病大鼠均出現(xiàn)視神經(jīng)病理改變，5只大鼠雙側(cè)、4只一側(cè)視神經(jīng)異常。HE染色示雙側(cè)視神經(jīng)包膜和神經(jīng)束膜見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，程度較脊髓和腦干輕。LFB染色示明顯脫髓鞘改變，主要位于包膜下、近視神經(jīng)內(nèi)部區(qū)域。病灶處髓鞘稀疏、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較輕。高倍鏡下變性的髓鞘染色深淺不一，因磷脂消失橫斷面呈半環(huán)狀或空白；有的脫髓鞘區(qū)出現(xiàn)髓鞘再生，再生的髓鞘深染、髓鞘環(huán)小、形狀多不規(guī)則。對(duì)照組大鼠和EAE模型組1只未發(fā)病大鼠的視神經(jīng)未見異常。

　　圖1  A：對(duì)照組大鼠脊髓橫斷面，無異常(HE×50)；B(HE×50)、C(HE×100)：EAE大鼠見血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；D：對(duì)照組大鼠脊髓和神經(jīng)根均未見髓鞘脫失(LFB×50)；E：EAE大鼠延髓見明顯炎癥反應(yīng)和脫髓鞘，脫髓鞘范圍廣泛，病灶邊界不清，相互融合(LFB×50)；F：為E的放大，示炎癥周圍髓鞘崩解，胞漿多為泡沫狀，箭頭示吞噬細(xì)胞內(nèi)的髓鞘碎片(LFB×400)；G：EAE大鼠炎癥及周圍輕度脫髓鞘，血管周圍呈現(xiàn)“花環(huán)”樣改變，并見神經(jīng)后根脫髓鞘，細(xì)箭頭所指(LFB×100)；H：為一只起病相對(duì)較緩的EAE大鼠，腦橋脫髓鞘病灶，邊界較清晰，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(LFB×50)；I：EAE大鼠坐骨神經(jīng)見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(HE×400)（略）

　　圖2  A：對(duì)照組大鼠視神經(jīng)無異常(LFB×50)； B：EAE大鼠視神經(jīng)橫斷面，見脫髓鞘改變，邊界較清(LFB×50)； C：EAE大鼠視神經(jīng)脫髓鞘病變伴髓鞘再生，見小、不規(guī)則、深染的再生髓鞘環(huán)(LFB×400)； D：EAE大鼠視神經(jīng)橫斷面，左側(cè)見相對(duì)完整的髓鞘，髓鞘環(huán)排列緊密，而右側(cè)為明顯脫髓鞘病變，病灶邊界清晰，髓鞘崩解，髓鞘環(huán)數(shù)密度降低(LFB×400)； E：對(duì)照組大鼠視神經(jīng)縱切面無異常(LFB×400)；F：EAE大鼠視神經(jīng)縱切面見明顯脫髓鞘病變(LFB×400)（略）

　　2.3.2  電鏡  見圖3。對(duì)照組大鼠視神經(jīng)髓鞘排列緊密、整齊，胞核飽滿，胞漿豐富，未見脫髓鞘。EAE模型大鼠視神經(jīng)存在明顯病變，病灶內(nèi)髓鞘腫脹，髓鞘板層松解，軸突髓鞘分離，髓鞘環(huán)數(shù)密度下降，髓鞘稀疏，完全性和不完全性的髓鞘脫失，伴有髓鞘再生。髓鞘形成細(xì)胞少突膠質(zhì)細(xì)胞（OLG）數(shù)量明顯減少，病灶OLGs胞核呈不同程度固縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，胞漿結(jié)構(gòu)松散。同時(shí)部分軸突病變，軸突內(nèi)線粒體腫脹、細(xì)胞器消失和微管結(jié)構(gòu)模糊。脫髓鞘區(qū)域和正常區(qū)域的邊界較清晰，病灶內(nèi)未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

　　圖3  視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)。A、B：對(duì)照組大鼠髓鞘環(huán)排列整齊無脫失，OLGs胞核飽滿，胞漿豐富(A×4200，B×9700)； C、D：EAE大鼠髓鞘明顯稀疏、排列不規(guī)則，髓鞘脫失(細(xì)黑箭頭)，伴有細(xì)、小、不規(guī)則的再生髓鞘(虛線白箭頭)；OLGs數(shù)量明顯減少，OLGs細(xì)胞核固縮(粗黑箭頭)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹（白箭頭），胞漿結(jié)構(gòu)松散，其周圍部分包裹的髓鞘板層松解，軸突髓鞘分離，空泡形成；部分OLGs凋亡(黑箭頭)；部分軸突線粒體腫脹，微管結(jié)構(gòu)模糊(C×4200，D×9700)（略）

　　3  討論
   
　　豚鼠脊髓勻漿誘導(dǎo)的Wistar大鼠EAE模型是國(guó)內(nèi)較成熟的EAE模型，該模型的發(fā)病率和穩(wěn)定性高［2,3］，是研究多發(fā)性硬化（MS）有效而經(jīng)濟(jì)的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)采用單次免疫，腳墊皮下注射，CFA與百日咳桿菌作為免疫增強(qiáng)劑，提高了大鼠EAE的發(fā)病率。病理檢查顯示EAE大鼠CNS的基本病理表現(xiàn)為炎性反應(yīng)和髓鞘脫失，同既往研究［4］報(bào)道的病理表現(xiàn)基本一致。
   
　　視神經(jīng)炎與MS、視神經(jīng)脊髓炎（NMO）之間存在密切的關(guān)系，但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。因此，建立相關(guān)動(dòng)物模型用以進(jìn)一步研究很有必要。炎癥性視神經(jīng)病變的動(dòng)物模型包括：（1）以CNS髓鞘抗原免疫誘導(dǎo)的EAE模型；（2）病毒誘導(dǎo)的脫髓鞘模型［4］；（3）抗體誘導(dǎo)的脫髓鞘模型［5］。其中以CNS髓鞘抗原免疫誘導(dǎo)的EAE模型較為常用。Sakuma等［6］發(fā)現(xiàn)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）免疫的各型LewisEAE大鼠，60%存在不同程度的視神經(jīng)病變。Shao等［7］以MOG或MOG特異T細(xì)胞免疫C57BL/6小鼠可誘導(dǎo)出較為嚴(yán)重的視神經(jīng)炎。Stefferl等［8］以MOG免疫Brown Norway大鼠誘導(dǎo)出僅累及視神經(jīng)和脊髓的模擬NMO的動(dòng)物模型，以MOG免疫M(jìn)OG特異的T細(xì)胞受體（TCR）轉(zhuǎn)基因小鼠也可模擬NMO，出現(xiàn)脊髓和視神經(jīng)的炎癥反應(yīng)和脫髓鞘［9］。國(guó)內(nèi)未有Wistar大鼠及其他EAE動(dòng)物模型視神經(jīng)病變的系統(tǒng)研究報(bào)道。本研究通過病理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)WistarEAE大鼠存在明顯的視神經(jīng)病變，所有臨床發(fā)病的WistarEAE大鼠均有視神經(jīng)病理異常，視神經(jīng)病變的發(fā)病率達(dá)到90%，故該模型可用作研究炎癥性視神經(jīng)病變的動(dòng)物模型。相比其他CNS區(qū)域，實(shí)驗(yàn)中觀察到視神經(jīng)的髓鞘脫失重于炎癥反應(yīng)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)病灶內(nèi)OLGs數(shù)量明顯減少，OLG胞漿腫脹，其周圍的髓鞘環(huán)板層結(jié)構(gòu)松解，而這種松解在髓鞘內(nèi)板層似乎更明顯，髓鞘板層與軸突分離。這提示OLGs病變引起了繼發(fā)性的脫髓鞘。病灶內(nèi)罕見炎性細(xì)胞，提示在這類病灶中可能體液免疫起重要作用。今后的研究方向可深入研究脫髓鞘疾病具體的發(fā)病機(jī)制，如視神經(jīng)、脊髓等與CNS其他區(qū)域局部免疫環(huán)境的分析，比較免疫組分側(cè)重、局部抗原加工提呈和血腦屏障特性的差別和不同種系遺傳差別等。

【參考文獻(xiàn)】
  　?。?］Kono DH. Two minor determinant of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice［Ｊ］. J Exp Med, 1988, 168:213.

　?。?］董梅，劉瑞春，郭力，等. Wistar大鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的模型建立［Ｊ］. 腦與神經(jīng)疾病雜志，2004，12：425.

　　［3］張為，曾麗，李家鑫，等.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠血CD4+CD25+T細(xì)胞的研究［Ｊ］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2006，19：365.

　?。?］Dal Canto MC, Melvold RW, Kim BS, et al. Two models of multiple sclerosis: experimental allergic encephalomyelitis (EAE) and Theilers murine encephalomyelitis virus (TMEV) infection: a pathological and immunological comparison［Ｊ］.Microsc Res Tech, 1995, 32:215.

　?。?］Zhou L, Trapp BD, Miller RH. Demyelination in the central nervous system mediated by an antioligodendrocyte antibody［Ｊ］. J Neurosci Res, 1998, 54:158.

　?。?］Sakuma, Hiroshi, Kohyama, et al. Clinicopathological study of a myelin oligodendrocyte glycoproteininduced demyelinating disease in LEW.1AV1 rats［Ｊ］. Brain, 2004, 127:2201.

　?。?］Shao H, Huang ZG, Sun SL,et al.Myelin/oligodendrocyte glycoproteinspecific Tcells induce sereve optic neuritis in the C57Bl/6 mouse［Ｊ］.Investigat Ophthalmol Visual Sci,2004,45:4060.

　　［8］Stefferl A, Brehm U, Storch M, et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein induces experimental autoimmune encephalomyelitis in the ‘resistant’ Brown Norway rat: disease susceptibility is determined by MHC and MHCli[x]nked effects on the B cell response［Ｊ］. J Immunol, 1999, 163: 40.

　　［9］Bettelli E, Baeten D, Jager A, et al. Myelin oligodendrocyte glycoproteinspecific T and B cells cooperate to induce a Deviclike disease in mice［Ｊ］. J Clin Invest, 2006,116:2393.