苦參總黃酮體內(nèi)外抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)研究

作者：孫明瑜, 左劍, 段繼峰, 韓軍, 范士明, 張煒, 朱麗芳, 姚明輝

作者單位：上海中醫(yī)藥大學(xué)曙光醫(yī)院, 上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所, 上海 201203

【關(guān)鍵詞】  苦參; 黃酮類; 抗腫瘤藥; 小鼠

     ob[x]jective: To explore the antitumor activities of kushen (Sophora flavescens) flavonoids (KS-Fs) in vivo and in vitro.

    Methods: Cell proliferation was assayed by using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. H22 hepatocellular carcinoma and S180 sarcoma were induced in ICR mice. Lewis lung carcinoma was induced in C57BL/6 mice. H460 and Eca-109 tumor were induced in Balb/c nude mice by injecting 5×105 or 5×106 tumor cells in the right flank, respectively.

    Results: KS-Fs could inhibit the growth of a variety of human tumor cell lines (A549, SPC-A-1, NCI-H460, etc.) in vitro. The antitumor efficacies were confirmed in the mice models of H22, S180 and Lewis lung tumors and the nude mice models of human H460 and Eca-109 xenografted tumors. The oral or intravenous maximum tolerated dose of KS-Fs was more than 2.8 g/kg or 750 mg/kg respectively, far more than the oral medial lethal dose of kushen alkaloids (≤1.18 g/kg). No adverse reactions were observed.

    Conclusion: These results suggest that KS-Fs or kurarinone may be developed as a novel antitumor agent.

    Keywords: Sophora flavescens; flavones; antineoplastic agents; mice

    苦參（Sophora flavescens Aiton）為豆科槐屬植物，是中國(guó)傳統(tǒng)常用中藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，常用于治療急、慢性炎癥和癌癥等疾病。苦參主要含有生物堿和黃酮兩大類化學(xué)成分［1］。1992年以苦參堿和氧化苦參堿為主的苦參總堿注射液?jiǎn)崽仂`［（92）衛(wèi)藥試字X-10（2）號(hào)］已作為抗腫瘤藥批準(zhǔn)上市。相對(duì)于苦參堿，苦參黃酮的研究較遲?，F(xiàn)已從苦參根中分離出56種黃酮類化合物，其中大部分化合物的A環(huán)上存在異戊烯基側(cè)鏈［2-14］。研究表明異戊烯基側(cè)鏈黃酮有抗病原微生物、抗炎、抗腫瘤（體外）等生物活性［2-14］。

    一系列從苦參中分離出的含異戊烯基側(cè)鏈的苦參黃酮在體外對(duì)一些人腫瘤細(xì)胞株有細(xì)胞毒活性，例如人白血病HL-60［2］、K562，小鼠白血病L1210［10］，人乳腺癌MCF-7［11］，非小細(xì)胞肺腺癌A549，卵巢癌SKOV-3［12］、1A9［9］，皮膚黑素瘤SK-MEL-2，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤XF498，腸癌HCT［12］，子宮頸癌HeLa［10］，鼻咽上皮癌KB，KB-Vin（drug-resistant variant KB）等細(xì)胞株［10］。這些黃酮還可以抑制一些酶的活性，例如phospholipase Cγ1［7］，diacylglycerol acyltransferase［9，13］，tyrosinase［5，14］，testosterone 5α-reductase［6］，cGMP phosphodiesterase 5［8］。但苦參黃酮在體內(nèi)是否有抑制腫瘤作用，目前國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

    本研究提取分離苦參總黃酮（kushen flavonoids, KS-Fs）和苦參酮（kurarinone, Kur），檢測(cè)KS-Fs和Kur對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，并比較KS-Fs與市售苦參堿（kushen alkaloids, KS-As）制劑（主要成分為苦參生物堿或氧化苦參堿）的細(xì)胞毒作用。考察KS-Fs和Kur對(duì)小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌及裸小鼠人移植腫瘤非小細(xì)胞肺癌H460和食管癌Eca-109的影響。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  藥物  苦參飲片，雷允上醫(yī)藥有限公司，經(jīng)鑒定為豆科槐屬植物苦參的根，苦參堿含量大于2%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》1995年版規(guī)定。苦參素（kushenin），寧夏制藥廠；苦參堿注射液，廣州明興制藥廠。體外實(shí)驗(yàn)：將KS-Fs和Kur用二甲亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）配制成20 mg/ml儲(chǔ)備液，－20 ℃貯存，臨用時(shí)用相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到所需終濃度。體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)：將KS-Fs和Kur用5% DMSO和9% Cremophor EL助溶后，加85%蒸餾水配成溶液。急性毒性實(shí)驗(yàn)注射配方：用10% DMSO和18% Cremophor EL溶解到大濃度，加蒸餾水配成終濃度為50 mg/ml溶液。急性毒性實(shí)驗(yàn)口服配方：20%聚乙二醇（PEG 400），18% Cremophor溶解到大濃度，加蒸餾水配制成混懸液，終濃度為70 mg/ml。注射用環(huán)磷酰胺（cytoxan, CTX），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)為04061821；注射用順鉑（cisplatin），齊魯制藥有限公司，批號(hào)為04051241；臨用時(shí)用生理鹽水稀釋。

    1.1.2  細(xì)胞株  肺癌A549、SPC-A-1、NCI-H460（H460）、H446，人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7，子宮頸癌HeLa，腸癌HCT-116、HT-29、SW-620和CaCo-2細(xì)胞株，均購(gòu)自美國(guó)菌種細(xì)胞保藏?cái)?shù)據(jù)庫(kù)（American Type Culture Collection, ATCC）；白血病HL-60、食管癌Eca-109、胃癌BGC-823和肝癌SMMC-7721細(xì)胞株以及小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌細(xì)胞，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物研究所。

    1.1.3  動(dòng)物  Balb/c-nu/nu裸小鼠，雄性，6～8周齡，18～22 g，上海市腫瘤研究所，合格證號(hào)：2002-0001。雌性ICR、C57BL/6小鼠，20～22 g；昆明鼠，雌雄各半，20～22 g。均購(gòu)自斯萊克動(dòng)物中心，合格證號(hào)：2003-0003。

    1.1.4  試劑  伊思考夫改良杜爾貝可培養(yǎng)基（Iscove’s modified Dulbecco’s medium, IMDM）、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）、1640培養(yǎng)基、胎牛血清和0.05%胰酶-乙二胺四乙酸，來(lái)自GIBCO公司；青霉素、鏈霉素、DMSO、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）和Cremophor EL，為Sigma公司產(chǎn)品。

    1.2  方法

    1.2.1  KS-Fs和Kur的分離提取  由和記黃埔醫(yī)藥有限公司提取鑒定。將苦參飲片粉碎成粗粉，10倍量95%乙醇滲漉，滲漉液經(jīng)減壓濃縮，加水以石油醚萃取，回收后得到KS-Fs粗提物。乙醇重溶解，過(guò)大孔樹(shù)脂得到KS-Fs，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)（ultraviolet rays, UV）方法檢測(cè)黃酮含量和純度。KS-Fs經(jīng)過(guò)聚酰胺和硅膠柱聯(lián)用層析分離提取得到Kur。

    5 kg苦參用乙醇滲漉、溶劑萃取得到KS-Fs粗提物126 g，得率為2.52%，黃酮含量超過(guò)55%。乙醇重溶解，過(guò)大孔樹(shù)脂得到KS-Fs，UV方法檢測(cè)黃酮含量，純度超過(guò)80%。KS-Fs經(jīng)過(guò)聚酰胺和硅膠柱聯(lián)用層析分離提取得到Kur。KS-Fs主要含有Kur，降苦參酮（norkurarinone, NKur）和二甲氧基苦參酮（2’-methoxy-kurarinone, MKur）及其他黃酮，其中Kur、NKur和MKur的含量分別是29.5%、4.6%和1.4%。見(jiàn)圖1。

    圖1  KS-Fs的高效液相圖譜和主要化合物結(jié)構(gòu)

    Figure 1  High-performance liquid chromatograms and chemical structures of compounds in KS-Fs

    1.2.2  KS-Fs和Kur在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞株的抑制作用  將（0.5～1）×105個(gè)生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換成含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，其中KS-Fs、Kur和其他待測(cè)藥物按梯度濃度加入，共設(shè)8個(gè)濃度，每孔中藥物溶劑（DMSO或水）的體積不超過(guò)1%總體積。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，MTT法檢測(cè)［15］。以溶劑孔為對(duì)照，數(shù)據(jù)用XLfit Wizard軟件分析，計(jì)算各藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration, IC50）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.3  KS-Fs和Kur體內(nèi)抗腫瘤作用

    1.2.3.1  小鼠腫瘤模型的建立  小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌細(xì)胞，采用中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所的培養(yǎng)基和血清濃度培養(yǎng)在25～75 ml培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。

    分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期S180和H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106/ml。ICR小鼠腹腔注射細(xì)胞懸液，每只0.2 ml。體內(nèi)腹水傳兩代后，無(wú)菌條件下抽取生長(zhǎng)良好的S180肉瘤或肝癌H22小鼠腹水，用生理鹽水稀釋至5×106/ml，充分混勻種植于小鼠右前腋下，每只0.2 ml。

    收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis肺癌細(xì)胞，以5×106/ml種植于C57BL/6小鼠右前腋下，每只0.2 ml。動(dòng)物種植腫瘤細(xì)胞后，每天觀察小鼠情況，待腫瘤長(zhǎng)出后，每隔2～3 d測(cè)量腫瘤直徑，并估計(jì)腫瘤質(zhì)量。體內(nèi)傳兩代后，待Lewis肺癌瘤塊長(zhǎng)到直徑大約1 cm左右時(shí)，選取腫瘤生長(zhǎng)旺盛，無(wú)潰破的腫瘤，在無(wú)菌條件下剝離腫瘤，去除壞死部分，剪成約1.5～2.0 mm3大小組織塊，皮下接種于6～8周齡健康的雌性C57BL/6小鼠右側(cè)腋下。

    1.2.3.2  裸鼠腫瘤模型的建立  收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H460和Eca-109細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105/ml或5×106/ml，無(wú)菌注射于Balb/c-nu/nu裸鼠右側(cè)背部近腋窩處，每只0.2 ml。裸鼠在標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌環(huán)境下飼養(yǎng)，每天觀察并測(cè)量腫瘤直徑，待腫瘤直徑大約為1cm左右時(shí)，保種傳代。腫瘤體積計(jì)算公式：V=（W2×L）/2，W代表腫瘤的寬度，L代表腫瘤的長(zhǎng)度［16］。在無(wú)菌條件下自保種傳代的H460或Eca-109裸鼠中剝離腫瘤，剪成約1.5～2.0 mm3大小組織塊，分別皮下接種于Balb/c-nu/nu裸鼠右側(cè)腋下，腫瘤塊體積大致相等。

    1.2.3.3  分組、給藥、測(cè)量和取材  小鼠接種H22肝癌第2天，將小鼠隨機(jī)分組，設(shè)KS-Fs溶劑對(duì)照組，KS-Fs高（500 mg/kg）、中（100 mg/kg）、低（20 mg/kg）劑量組，CTX（30 mg/kg）陽(yáng)性對(duì)照組。小鼠接種S180肉瘤第2天，Lewis肺癌小鼠腫瘤長(zhǎng)至150 mm3左右時(shí)（接種后第8天），將小鼠隨機(jī)分組，設(shè)KS-Fs溶劑對(duì)照組，KS-Fs高（200 mg/kg）、低（60 mg/kg）劑量組，CTX（30 mg/kg）陽(yáng)性對(duì)照組。各組小鼠均腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)7 d，給藥體積為10 ml/kg體質(zhì)量。每天觀察小鼠的一般情況，體質(zhì)量變化，每周測(cè)量2次小鼠體質(zhì)量。小鼠接種S180肉瘤、H22肝癌腫瘤后10 d及接種Lewis肺癌后18 d結(jié)束實(shí)驗(yàn)。脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤，稱瘤質(zhì)量，計(jì)算瘤質(zhì)量抑瘤率，腫瘤質(zhì)量抑制率（%）=（對(duì)照組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量）/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100［17］。

    裸小鼠腫瘤長(zhǎng)到100 mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分組并開(kāi)始給藥。設(shè)溶媒對(duì)照組，只給予相應(yīng)溶劑；陽(yáng)性藥對(duì)照組，靜脈注射順鉑（2 mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥7 d）；KS-Fs組，靜脈注射KS-Fs 200 mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥21 d。人移植腫瘤Eca-109裸小鼠加設(shè)Kur靜脈注射高（200 mg/kg）、低（50 mg/kg）劑量組，1次/d，連續(xù)給藥21 d。人非小細(xì)胞肺癌H460和食管癌Eca-109腫瘤移植裸小鼠分別于給藥后第25天和第22天結(jié)束實(shí)驗(yàn)。脫頸椎處死裸小鼠，剝離腫瘤，稱取瘤質(zhì)量，計(jì)算瘤質(zhì)量抑瘤率。

    每天觀察裸鼠的一般情況，體質(zhì)量變化，計(jì)算相對(duì)體質(zhì)量（relative body weight, RBW），每只裸鼠的RBW是測(cè)量時(shí)的裸鼠體質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)初始狀態(tài)時(shí)裸鼠體質(zhì)量的比；每周測(cè)量2次移植瘤體積，計(jì)算相對(duì)瘤體積（relative tumor volume, RTV），每個(gè)腫瘤的RTV是測(cè)量時(shí)的腫瘤體積與實(shí)驗(yàn)初始狀態(tài)時(shí)腫瘤體積的比［18］）。描繪腫瘤生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算腫瘤的生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率（%）=（溶媒組RTV－治療組RTV）/溶媒組RTV×100。

    1.2.4  急性毒性試驗(yàn)  昆明鼠隨機(jī)分為4組：口服溶媒對(duì)照組，口服KS-Fs組，靜脈注射溶媒對(duì)照組，靜脈注射KS-Fs組，每組各10只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，小鼠禁食16 h，口服組單次給予大給藥體積0.04 ml/g，KS-Fs給藥劑量2.80 g/kg；靜脈注射組單次給予大給藥體積0.015 ml/g，KS-Fs給藥劑量750 mg/kg，連續(xù)觀察14 d。

    1.2.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±sx表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用方差分析和q檢驗(yàn)。

    2  結(jié)  果

    2.1  KS-Fs和Kur體外對(duì)腫瘤細(xì)胞株的抑制作用  首先考察了KS-Fs對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明KS-Fs可抑制H460、A549、BGC-823、SMMC-7721、HT-29和SW-620細(xì)胞的增殖，IC50分別為12.4、8.9、12.1、18.06、21.95和18.26 μg/ml。KS-Fs與市售苦參堿抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KS-Fs對(duì)SPC-A-1和Eca-109細(xì)胞的IC50分別為（15.3±0.5）μg/ml和（12.4±0.4）μg/ml，均遠(yuǎn)低于市售苦參素和苦參堿（IC50>200 μg/ml）。見(jiàn)圖2。

    在多個(gè)細(xì)胞株上驗(yàn)證了KS-Fs抑制腫瘤增殖作用。結(jié)果證明KS-Fs對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H446，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460、A549、SPC-A-1，結(jié)直腸癌細(xì)胞株CaCo-2、HCT-116、HT-29、SW-620，乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231，食管癌細(xì)胞Eca-109，肝癌SMMC-7721等均有細(xì)胞毒作用，IC50為4.9～29.4 μg/ml，其中對(duì)H446、HeLa和A549的IC50均小于10 μg/ml，對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的IC50則小于5 μg/ml。Kur細(xì)胞毒作用強(qiáng)于KS-Fs，IC50為2.0～13.1 μg/ml。

    2.2  KS-Fs和Kur體內(nèi)抗腫瘤作用及毒性實(shí)驗(yàn)

    2.2.1  KS-Fs和Kur對(duì)H22肝癌、S180肉瘤和Lewis肺癌小鼠的影響  為考察KS-Fs是否在體內(nèi)有直接抗腫瘤作用，首先利用H22肝癌模型小鼠評(píng)價(jià)KS-Fs的劑量效應(yīng)關(guān)系。溶媒組小鼠在接種H22肝癌第10天腫瘤質(zhì)量達(dá)到2.47 g，體積超過(guò)800 mm3，20、100和500 mg/kg KS-Fs腹腔注射，對(duì)小鼠肝癌H22腫瘤的生長(zhǎng)呈明顯的劑量依賴抑制作用（P<0.01），瘤質(zhì)量抑瘤率分別為43.40%、66.45%和78.98%。見(jiàn)表1和圖3。低、中、高劑量KS-Fs對(duì)小鼠的體質(zhì)量均沒(méi)有顯著影響，小鼠一般狀態(tài)良好。見(jiàn)表1。表1  KS-Fs對(duì)H22肝癌小鼠腫瘤和體質(zhì)量的影響（略）

    接下來(lái)，為進(jìn)一步確證KS-Fs的體內(nèi)抗腫瘤作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了S180和Lewis肺癌小鼠腫瘤實(shí)驗(yàn)。溶媒組小鼠在接種S180肉瘤第10天腫瘤質(zhì)量達(dá)到2.91 g，體積超過(guò)1 000 mm3，60、200 mg/kg KS-Fs腹腔注射，對(duì)小鼠S180肉瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用（P<0.01），瘤質(zhì)量抑瘤率分別為72.52%、82.14%。見(jiàn)表2和圖3。溶媒組小鼠在接種Lewis肺癌第18天腫瘤質(zhì)量達(dá)到2.57 g，腹腔注射60和200 mg/kg KS-Fs，對(duì)小鼠Lewis肺癌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用（P<0.01），瘤質(zhì)量抑瘤率分別為40.26%和59.74%。與溶媒組相比，CTX組動(dòng)物體質(zhì)量顯著下降（P<0.05），而KS-Fs高、低劑量組小鼠的體質(zhì)量均沒(méi)有明顯下降。見(jiàn)表3。

    為評(píng)價(jià)KS-Fs的安全性，我們進(jìn)行了小鼠急性毒性試驗(yàn)，結(jié)果口服及靜脈注射KS-Fs的半數(shù)致死量（lethal dose 50%, LD50）都未測(cè)出?？诜竽褪軇┝看笥?.8 g/kg；靜脈注射大耐受劑量大于750 mg/kg。動(dòng)物無(wú)任何異常表現(xiàn)。

    2.2.2  KS-Fs和（或）Kur對(duì)人非小細(xì)胞肺癌H460和人Eca-109裸鼠移植模型的影響  為驗(yàn)證Ks-Fs在體內(nèi)對(duì)人移植腫瘤裸小鼠的抗腫瘤作用，考察了KS-Fs和（或）Kur對(duì)人非小細(xì)胞肺癌H460和人Eca-109裸鼠移植模型的影響。接種H460腫瘤的裸鼠，溶媒對(duì)照組的腫瘤RTV在治療開(kāi)始第4天達(dá)到2.41，至第25天，RTV達(dá)到了36.04，腫瘤質(zhì)量達(dá)到3.19 g；靜脈注射200 mg/kg KS-Fs，第4天至第25天均能顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)（P<0.05，P<0.01），第25天腫瘤質(zhì)量降至1.70 g，瘤質(zhì)量抑瘤率（46.8%）與順鉑組相當(dāng)（47.1%）。順鉑組裸小鼠體質(zhì)量在治療第4天開(kāi)始顯著下降（P<0.01），在整個(gè)治療過(guò)程中，體質(zhì)量與溶媒組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），低體質(zhì)量下降至治療前體質(zhì)量的75%（P<0.05，P<0.01）。KS-Fs組的相對(duì)體質(zhì)量在4、7、21和25 d與溶媒組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在4、7、11、15和18 d，明顯高于順鉑組（P<0.05）。見(jiàn)表4和圖4。

    接種Eca-109腫瘤的裸鼠，對(duì)照組的腫瘤RTV在治療開(kāi)始第4天達(dá)到1.8，至第22天RTV達(dá)到了9.1，而腫瘤質(zhì)量達(dá)到1.1 g；靜脈注射200 mg/kg KS-Fs或Kur，從第4天開(kāi)始至第22天均能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)（P<0.05），腫瘤質(zhì)量分別為0.30 g、0.31 g，瘤體積抑瘤率分別為47.2%、42.7%，與順鉑（50.1%）組相當(dāng)，KS-Fs組和Kur組的相對(duì)體質(zhì)量與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；KS-Fs組在4、8、11、15和18 d，明顯高于順鉑組（P<0.05）。見(jiàn)表5和圖4。表2  KS-Fs對(duì)S180肉瘤小鼠腫瘤和體質(zhì)量的影響（略）表4  第25天時(shí)KS-Fs對(duì)人H460非小細(xì)胞肺癌裸小鼠移植腫瘤模型的影響（略）    表5  第22天時(shí)KS-Fs和Kur對(duì)人Eca-109食管癌裸小鼠移植腫瘤模型的影響（略） 綜上所述，體內(nèi)藥效試驗(yàn)表明KS-Fs和（或）Kur對(duì)小鼠H22肝癌、S180肉瘤和Lewis肺癌和人移植腫瘤食管癌Eca-109和非小細(xì)胞肺癌H460裸小鼠模型均有較好的抗腫瘤作用。20～500 mg/kg KS-Fs對(duì)小鼠S180、H22和Lewis肺癌的抑制率均大于40%，200 mg/kg KS-Fs腹腔注射對(duì)S180腫瘤的抑制率超過(guò)80%，對(duì)Lewis肺癌達(dá)到59.7%；500 mg/kg KS-Fs對(duì)H22腫瘤瘤質(zhì)量抑制率達(dá)到79%；200 mg/kg KS-Fs靜脈注射對(duì)人移植腫瘤H460和Eca-109裸小鼠的腫瘤瘤質(zhì)量抑制率也大于40%；200 mg/kg Kur靜脈注射對(duì)Eca-109的抑制腫瘤作用與KS-Fs相當(dāng)。

    3  討  論

    文獻(xiàn)報(bào)道苦參黃酮對(duì)多種細(xì)胞株有細(xì)胞毒作用，其中Kur是KS-Fs中主要的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的黃酮之一。Kur對(duì)人白血病HL-60、肝癌HepG2、肺癌A549、卵巢癌SKOV-3、黑色素皮膚癌SK-MEL-2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤XF498、結(jié)腸癌HCT15、結(jié)腸癌HCT15/CL02、神經(jīng)膠質(zhì)瘤SF295的IC50分別為18.5、36.2、9.0、7.29、6.4、5.9、7.37、14.34和7.38 μg/ml［7，8，13，19］。KS-Fs中另外兩個(gè)主要成分NKur和MKur也對(duì)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒作用，NKur對(duì)SF295、SKOV-3、HCT15、HCT15/CL02、A549 和SKMEL-2的IC50分別為4.25、5.63、5.46、12.14、15.4和12.9 μg/ml［13，19］；MKur對(duì)HL-60和HepG2的IC50分別是13.7和21.1 μg/ml［7，13］。我們的研究結(jié)果揭示，KS-Fs和Kur對(duì)多個(gè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)呈劑量依賴抑制作用，KS-Fs的IC50為4.9～29.4 μg/ml，Kur作為KS-Fs的主要成分，細(xì)胞毒作用強(qiáng)于KS-Fs，IC50范圍為2.0～13.1 μg/ml。

    文獻(xiàn)記載苦參堿或氧化苦參堿對(duì)白血病K562、乳腺癌MCF-7、卵巢癌SKOV-3和肝癌HepG2 等腫瘤細(xì)胞株的IC50均在200 μg/ml以上，一般多為500～1 000 μg/ml［20-22］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明KS-Fs對(duì)非小細(xì)胞肺癌SPC-A-1和食管癌Eca-109細(xì)胞的細(xì)胞毒作用遠(yuǎn)強(qiáng)于已經(jīng)上市的苦參堿（氧化苦參堿）制劑——苦參素（寧夏）和苦參堿（廣州）?？梢?jiàn)KS-Fs和Kur都比苦參堿（氧化苦參堿）有更好的細(xì)胞毒作用，有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究的價(jià)值。

    目前國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道苦參黃酮的體內(nèi)抑制腫瘤作用。我們證明KS-Fs能抑制小鼠H22肝癌和S180肉瘤，而且對(duì)小鼠Lewis肺癌及人食管癌Eca-109和非小細(xì)胞肺癌H460腫瘤移植裸小鼠模型均有較好的腫瘤抑制作用。200 mg/kg KS-Fs連續(xù)腹腔注射7 d對(duì)小鼠H22和S180腫瘤的瘤質(zhì)量抑制率均大于80%，作用強(qiáng)于苦參堿和氧化苦參堿（40%～60%）［1］。而Kur作為KS-Fs的主要組成成分，對(duì)食管癌Eca-109裸鼠移植腫瘤的瘤質(zhì)量抑制率與KS-Fs作用相近，大于40%；對(duì)胃癌BGC-823和喉癌Hep-2裸小鼠移植腫瘤的瘤質(zhì)量抑制率分別為39%和31%，Kur基本能夠代表KS-Fs抗腫瘤作用的主成分。

    苦參總堿小鼠口服的LD50為1.18 g/kg［23］，苦參堿和氧化苦參堿腹腔注射，小鼠的LD50分別是150 mg/kg和750 mg/kg［24］。KS-Fs口服和靜脈注射的LD50均沒(méi)有測(cè)出，口服大耐受量大于2.8 g/kg，靜脈注射大耐受劑量則大于750 mg/kg，動(dòng)物均無(wú)異常表現(xiàn)。治療劑量連續(xù)靜脈注射兩周，對(duì)動(dòng)物體質(zhì)量和血象、骨髓均無(wú)影響?？梢?jiàn)KS-Fs比苦參堿毒性更小，更為安全。

    本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果證明KS-Fs和Kur是安全有效的中藥抗腫瘤有效部位（單體），極有可能像苦參堿一樣開(kāi)發(fā)成新的抗腫瘤植物藥。

 

【參考文獻(xiàn)】
  1 State Administration of Traditional Chinese Medicine. Chinese herbal medicine. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers. 1999: 634-643. Chinese.

國(guó)家中醫(yī)藥管理局. 中華本草. 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社. 1999: 634-643.

2 Kyogoku K, Hatayama K, Komatsu M. Constituents of Chinese crude drug “Kushen” (the root of Sophora flavescens Ait.). Isolation of five new flavonoids and formononetin. Chem Pharm Bull. 1973; 21(12): 2733-2738.

3 Zhao YY, Wang B, Lei LM, et al. Constituents of the flavonoids from the roots of Sophora flavescens. Zhi Wu Xue Bao. 1993; 35(4): 304-306.

趙玉英, 王邠, 雷黎明, 等. 苦參黃酮類成分的研究. 植物學(xué)報(bào). 1993; 35(4): 304-306.

4 Ryu SY, Kim SK, No Z, et al. A novel flavonoid from Sophora flavescens. Planta Med. 1996; 62(4): 361-363.

5 Woo ER, Kwak JH, Kim HJ, et al. A new prenylated flavonol from the roots of Sophora flavescens. J Nat Prod. 1998; 61(12): 1552-1554.

6 Kuroyanagi M, Arakawa T, Hirayama Y, et al. Antibacterial and antiandrogen flavonoids from Sophora flavescens. J Nat Prod. 1999; 62(12): 1595-1599.

7 Kang TH, Jeong SJ, Ko WG, et al. Cytotoxic lavandulyl flavanones from Sophora flavescens. J Nat Prod. 2000; 63(5): 680-681.

8 Ko WG, Kang TH, Kim NY, et al. Lavandulyl flavonoids: a new class of in vitro apoptogenic agents from Sophora flavescens. Toxicol In Vitro. 2000; 14(5): 429-433.

9 Ding PL, Chen DF, Bastow KF, et al. Cytotoxic isoprenylated flavonoids from the roots of Sophora flavescens. Helvetica Chimica Acta. 2004; 87(10): 2574-2580.

10 Kim YK, Min BS, Bae KH. A cytotoxic constituent from Sophora flavescens. Arch Pharm Res. 1997; 20(4): 342-345.

11 De Naeyer A, Vanden Berghe W, Pocock V, et al. Estrogenic and anticarcinogenic properties of kurarinone, a lavandulyl flavanone from the roots of Sophora flavescens. J Nat Prod. 2004; 67(11): 1829-1832.

12 Ha TJ, Yang SY, Jang DS, et al. Inhibitory activities of flavanone derivatives isolated from Sophora flavescens for melanogenesis. Bull Korean Chem Soc. 2001; 22(1): 97-99.

13 Kang SS, Kim JS, Xu YN, et al. Isolation of a new cerebroside from the root bark of aralia elata. J Nat Prod. 1999; 62(7): 1059-106.

14 Chung MY, Rho MC, Ko JS, et al. In vitro inhibition of diacylglycerol acyltransferase by prenylflavonoids from Sophora flavescens. Planta Med. 2004; 70(3): 258-260.

15 Carmichael J, Mitchell JB, DeGraff WG, et al. Chemosensitivity testing of human lung cancer cell lines using the MTT assay. Br J Cancer. 1988; 57(6): 540-547.

16 Bissery MC, Guénard D, Guéritte-Voegelein F, et al. Experimental antitumor activity of Taxotere (RP 56976, NSC 628503), a Taxol analogue. Cancer Res. 1991; 51(18): 4845-4852.

17 Xu SY, Bian RL, Chen X. Pharmacological experimental methods. 3rd ed. People’s Medical Publishing House. 2002: 1762. Chinese.

徐叔云, 卞如廉, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué). 第三版. 人民衛(wèi)生出版社. 2002: 1762.

18 Sancéau J, Poupon MF, Delattre O, et al. Strong inhibition of Ewing tumor xenograft growth by combination of human interferon-alpha or interferon-beta with ifosfamid. Oncogene. 2002; 21(50): 7700-7709.

19 Hoi SU, Kim KH, Choi EJ, et al. P-glycoprotein (Pgp) does not affect the cytotoxicity of flavonoids from Sophora flavescens, which also have no effects on Pgp action. Anticancer Res. 1999; 19(3): 2035-2040.

20 Zhang LP, Jiang JK. Study of matrine on proliferation and differentiation of K562 cell line. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 1999; 20(6): 315-316. Chinese.

張莉萍, 蔣紀(jì)愷. 苦參堿對(duì)K562細(xì)胞增殖與分化作用的機(jī)制研究. 中華血液學(xué)雜志. 1999; 20(6): 315-316.

21 Zhou BG, Sun JZ, Su G, et al. Apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells induced by oxymatrine. Zhonghua Shi Yan Wai Ke Za Zhi. 2002; 18(6): 689-691. Chinese with abstract in English.

周炳剛, 孫靖中, 蘇剛, 等. 氧化苦參堿誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡的實(shí)驗(yàn)研究. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志. 2002; 18(6): 689-691.

22 Li LJ, Chen ZQ, Zheng YY, et al. Effects of oxymatrine on human ovarian cancer cell SKOV-3 in vitro. Shi Yong Zhong Liu Xue Za Zhi. 2003; 17(2): 100-101. Chinese.

李龍江, 陳志瓊, 鄭元義, 等. 氧化苦參堿對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3體外活性的影響. 實(shí)用腫瘤學(xué)雜志. 2003; 17(2): 100-101.

23 Wang YS. Chinese herbal drug pharmacology and application. Beijing: People’s Medical Publishing House. 1983: 638. Chinese.

王浴生. 中藥藥理與應(yīng)用. 北京: 人民衛(wèi)生出版社. 1983: 638.

24 Li XR. Effects of 7 alkaloids from Kudouzi on immune function in mice. Zhong Cao Yao. 1987; 18(5): 22-23. Chinese.