卵巢上皮性癌組織中DAPK基因啟動子甲基化及其蛋白表達的研究

         卵巢癌為女性生殖系統(tǒng)三大常見惡性腫瘤之一，死亡率居首。病因及發(fā)病機制至今尚不明確，因起病隱匿、缺乏早期診斷指標，多數(shù)確診時已屬晚期.總體5年生存率仍未超過45%’卵巢上皮性癌占:一;巢癌的85%一90%，研究卵巢上皮性癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的生物標記物和治療靶點，改善預后仍是研究的熱點。死亡相關蛋白激酶(death-as-sociatedproteinkinasegene,DAPK)是凋亡的正性調節(jié)因子，作為抑癌基因，在多種人類腫瘤中由于啟動子甲基化而表達缺失。國外研究報道DAPK基因啟動子在卵巢上皮性癌中的甲基化率0一67%不等，存在分歧，仍需進一步研究。本研究通過對卵巢上皮性癌中DAPK基因啟動子甲基化及蛋白表達的檢測，探討DAPK在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為卵巢癌的診治尋找新的方向。 　　
         1材料與方法 　　
         1.1材料
　　1.1.1組織標本
　　收集2009年1月至2012年3月鄭州大學第三附屬醫(yī)院病理科135例石蠟包埋組織，經病理證實為卵巢上皮性癌組織(惡性組)55例，卵巢交界性上皮腫瘤(交界組)25例，卵巢良性上皮性腫瘤(良性組)30例，正常卵巢上皮組織(正常組)25例。正常卵巢組織來源于因良性疾病行子宮加雙附件切除術的患者。卵巢上皮性癌患者年齡為23一78歲，中位年齡為53歲，其中漿液性囊腺癌35例，豁液性囊腺癌12例，子宮內膜樣癌8例。按國際婦產科聯(lián)盟(FIGO)分期:I一II期15例，Ⅲ一IV期40例;低分化19例，中一高分化36例;淋巴結轉移29例，無淋巴結轉移26例;術前均未行放療和化療。所有標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，行4um厚連續(xù)切片用于免疫組織化學，收集10um厚連續(xù)切片5一10張置PE管保存以用于提取DNA。全部標本均由病理科醫(yī)師再次診斷證實，標本使用符合倫理委員會認可。 　　
         1.1.2試劑
　　DAPK兔抗人多克隆抗體(工作濃度1:50)購自北京博奧森生物技術有限公司二抗及顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司:甲基化特異性試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司。 　　
         1.2方法
　　1.2.1DNA的提取和甲基化特異性PCR(MSP)石蠟組織中DNA提取方法:采用酚一氯仿法提取石蠟組織中的DNA，并按照甲基化特異性PCR試劑盒說明書進行亞硫酸氫鹽修飾，-20℃保存?zhèn)溆没蛑苯訑U增。由北京博大泰克生物技術有限公司設計合成2對引物。甲基化引物正義鏈為5'-GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC-3'，反義鏈為5'-CCCTCCCAAACGCCGA-3'，擴增產物長度為98by;未甲基化引物正義鏈為5'-GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3'，反義鏈為5'-CAAATCCCTCCCAAACACCAA-3'，擴增產物長度為106bp。 　　
         1.2.2MSP反應反應體系:亞硫酸氫鹽修飾后DNA1uL，上下游引物各1uL,lOxPCR緩沖液5uL,高效DNA聚合酶1uL,dNTPs4uL加3dH20至50uL反應條件:94℃預變性5min,1個循環(huán);94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35個循環(huán);72℃總延伸6min。取產物5uL于2%瓊脂糖凝膠上電泳。甲基化結果判斷:甲基化引物擴增出目的條帶者為甲基化陽性;非甲基化引物擴增出目的條帶，或甲基化引物未擴增出目的條帶者為甲基化陰性。 　　
         1.2.3DAPK蛋白表達檢測方法采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶連接(S-P)法，具體實驗步驟按試劑盒說明進行。陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。免疫組織化學結果判定:DAPK蛋白表達于胞漿，免疫組織化學染色以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。依據(jù)細胞著色強度和陽性細胞百分率進行半定量評分〔5。著色強度:輕度著色為1分，中度著色為2分，強著色為3分。每張染色切片隨機選取10個高倍視野(x400)，計算10個視野的平均陽性細胞百分率。陽性細胞百分率:<10%為1分，10%一49%為2分，50%}80%為3分，>80%為4分。兩項乘積為免疫染色的總分?？偡?一1分為陰性(一),2一4分為弱陽性(+),5--8分為中度陽性(++)，9一12分為強陽性(+++)。 　　
         1.3統(tǒng)計學方法 　　
         1.3統(tǒng)計學方法 　　
         采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組定性資料比較應用丫檢驗，檢驗水準a=0.05，組間兩兩比較時應用四格表X’檢驗，檢驗水準a'=a/比較次數(shù)，為0.0083兩分類變量的相關性分析應用配對資料的關聯(lián)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，關聯(lián)程度使用Pearson列聯(lián)系數(shù)(rp)表示。 　　
         2結果
　　2.1DAPK基因在不同卵巢組織中的甲基化情況
　　正常卵巢上皮組織未擴增出甲基化陽性條帶，良性、交界性及惡性卵巢上皮性腫瘤組織中均可擴增出甲基化陽性條帶DAPK基因啟動子在正常組、良性組、交界組、惡性組中的甲基化率分別為0(0/25),6.7%(2/30),16.0%(4/25),47.3%(26/55)，差異有統(tǒng)計學意義(才=38.070,P<0.001)。惡性組和正常組、良勝組、交界組分別比較差異均有統(tǒng)計學意義(X分別為17.508、14.489,7.172,P<0.001,P<0.001,P=0.007)。正常組和良性組、正常組和交界組、良性組和交界組比較差異均無統(tǒng)計學意義(x分別為0.350,2.446,1.222,P=0.554,P=0.118,P=0.269)。 　　
         2.2DAPK蛋白在不同卵巢上皮組織中的表達情況 　　DAPK蛋白在正常卵巢組織和良勝卵巢上皮性腫瘤組織中高表達，以(++)和(+十+)為主，陽性率分別為96.0%(24/25),90.0%(27/30)，而在交界性卵巢上皮腫瘤組織及卵巢上皮性癌組織中表達下降或缺失，以(+)和(-)為主，陽性率分別為48.0%(12/25),30.9r"}(17/55)，差異有統(tǒng)計學意義(X-=45.344,P<0.001，正常組和交界組、惡性組比較，良性組和交界組、惡性組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(X-分別為14.286,29.146、11.661、27.600，P<0.001、P<0.001、P=0.001、P<0.001)。正常組和良勝組比較，交界組和惡性組比較差異均無統(tǒng)計學意義(X-分別為0.11,2.172,P=0.74,P=0.14)。 　　
         2.3卵巢上皮性癌中DAPK基因啟動子甲基化及其蛋白表達的相關性分析 　　26例擴增出甲基化條帶的卵巢上皮性癌組織中1例DAPK蛋白表達陽性，29例未擴增出甲基化條帶的卵巢上皮性癌組織中13例DAPK蛋白表達陰性。DAPK基因啟動子甲基化與其蛋白的表達與之間呈負相關(X-=16.911,P<0.001,r-=0.485）。 　　
         2.4DAPK基因啟動子甲基化及其蛋白表達與卵巢上皮性癌臨床病理特征的關系 　　
         DAPK基因啟動子甲基化及其蛋白表達與卵巢上皮性癌的分期、病理類型、組織分化均無關(P>0.05),DAPK基因甲基化及其蛋白表達均與淋巴結轉移有關(P<0.05)。 　　
        

         3討論
　　卵巢癌的發(fā)生是多步驟、多因素、多機制參與的復雜過程，其中包括癌基因的激活和抑癌基因的失活?；蚣谆徽J為是抑癌基因失活的重要機制。卵巢癌中存在多種腫瘤相關基因頻繁甲基化現(xiàn)象，包括OPCML,GATA4,TES,TGFBI以及本研究中的DAPKDAPK是一種鈣調蛋自調節(jié)的組氨卿蘇氨酸蛋白激酶，通過誘導凋亡和自噬，并抑制腫瘤細胞薪附、浸襲、遷移和轉移，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。在腫瘤形成的早期階段，DAPK依賴p19ARF活化p53介導的凋亡檢查點，阻止癌基因的活化。DAPK活化后可促進p53表達和轉錄能力，導致Caspase依賴的細胞死亡。在腫瘤轉移的多階段過程DAPK增加腫瘤細胞對程序性細胞死亡的敏感性而抑制腫瘤轉移。DAPK通過抑制整聯(lián)蛋白介導的細胞粘附而活化依賴p53的細胞凋亡，并能抑制細胞外基質生存信號誘導凋亡。特定情況下自噬可以抑制腫瘤發(fā)生，DAPK可通過多途徑多階段調節(jié)自噬發(fā)揮腫瘤抑制作用。 　　
         Collins等研究發(fā)現(xiàn)DAPK基因啟動子在30例卵巢癌組織樣本中20例(67%)發(fā)生了甲基化，在26例卵巢癌患者的外周血樣本中14例(54%)出現(xiàn)了甲基化，在正常個體基因組DNA樣本及轉化的正常卵巢上皮細胞株中均未發(fā)生甲基化。Hafne:等”研究發(fā)現(xiàn)50%(16/32)卵巢癌組織標本中存在DAPK基因甲基化，56%(13/23)的卵巢癌患者血漿中存在DAPK基因甲基化。本研究發(fā)現(xiàn)DAPK基因啟動子在卵巢上皮性癌組織樣本中的甲基化率為47.3%(26/55)，與上述研究結果一致。本研究還顯示，DAPK基因啟動子在正常組中未發(fā)生甲基化，在良性組、交界組、惡性組甲基化率逐漸升高，惡性組高于其他三組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0083)，提示DAPK基因啟動子甲基化可能為卵巢上皮性癌發(fā)生過程中的早期事件和重要事件。 　　
         DAPK在Barren食管腺癌、胃癌、宮頸癌等人類腫瘤中表達下調或丟失，且均與其基因啟動子甲基化有關,本研究發(fā)現(xiàn)DAPK蛋白在正常組、良性組、交界組、惡性組的表達逐漸降低，交界組和惡性組明顯低于正常組和良哇組，提示DAPK表達下調或丟失參與了卵巢上皮性癌由良性一交界一惡性的發(fā)展過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)DAPK在卵巢上皮性癌中表達下調或丟失與其啟動子的甲基化相關，與其在上述人類腫瘤中的研究結果一致，提示DAPK基因啟動子甲基化可導致基因沉默、失活、蛋白表達下調或丟失，使其誘導凋亡和自噬、抑制腫瘤轉移等作用減弱而促進了卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展。 　　本研究結果顯示基因水平與蛋白水平存在不一致現(xiàn)象:基因水平DAPK基因啟動子甲基化在交界組和惡性組有差異，但蛋白表達在交界組和惡性組間無差異，且29例未發(fā)生甲基化的卵巢上皮性癌組織中仍有13例陰性表達，原因可能是除了甲基化外DAPK還可通過組蛋白去乙酞化、基因突變、轉錄后調控等機制影響基因表達。 　　
         DAPK基因甲基化與卵巢上皮性癌的臨床分期、病理類型、組織分化均無關，與Collins等研究結果一致DAPK蛋白表達與卵巢上皮性癌的臨床分期、病理類型、組織分化亦無關DAPK基因甲基化及其蛋白表達均與淋巴結轉移有關，這可能與DAPK失活后不能正常發(fā)揮抑制腫瘤轉移的能力有關淋巴結轉移常關系到患者的預后研究發(fā)現(xiàn)在胃癌中DAPK甲基化與其預后相關，但Collins等研究發(fā)現(xiàn)DAPK甲基化與卵巢癌患者生存無關，DAPK與卵巢癌預后的關系仍有待今后進一步研究。 　　
         本研究發(fā)現(xiàn)卵巢上皮性癌組織中DAPK基因啟動子發(fā)生了中等程度甲基化現(xiàn)象，可能為DAPK表達下調或缺失的主要機制之一，并參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，且可能與卵巢癌預后有關DAPK基因啟動子甲基化為卵巢癌發(fā)生的早期事件，已研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者的外周血中存在DAPK的同步甲基化“.通過檢測血液中DAPK基因甲基化將可能有助于卵巢癌的早期診斷。基因甲基化具有可逆性，通過去甲基化藥物恢復DAPK基因表達及其抑癌功能有望成為上皮性卵巢癌治療的新靶點。 　　
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