雙調(diào)控雙功效溶瘤腺病毒對肝癌的抑制作用

　　觀察表達(dá)Survivin基因小發(fā)卡RNA(shRNA)和內(nèi)皮抑素基因(mE)的雙調(diào)控雙功效的腫瘤特異性溶瘤腺病毒在體內(nèi)外實驗中對肝癌的抗癌活性.方法以重組的雙調(diào)控雙功效的腫瘤特異性溶瘤腺病毒感染肝癌細(xì)胞,Westernblot鑒定肝癌細(xì)胞基因的蛋白表達(dá),噻唑藍(lán)(MTT)實驗檢測癌細(xì)胞增殖活性;建立肝癌裸鼠移植瘤模型,給予溶瘤腺病毒治療,觀察對移植瘤生長的抑制作用.
　　3.溶瘤腺病毒CNHK500-shRNA-mE抗肝癌移植瘤療效:裸鼠皮下接種5x106個細(xì)胞的SMMC-7721,2周后成瘤.分組用重組病毒瘤內(nèi)多點注射,治療病毒總量為1x1擴(kuò)pfu.至治療后35d,與對照組比較,CNHK500-shRNA-mE,CNHK500-shRNA,CNHK500-mE,Ad-mE對肝癌移植瘤生長的抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義,抑瘤率分別為77.41%(P<0.01),59.27%(P<0.O5),35.96%(P<0.O1)和25.94%(P<0.O5),以CNHK500-shRNA-mE抑瘤作用強(qiáng).同時攜帶shRNA和mE的雙功效溶瘤腺病毒CNHK500-shRNA-mE比任一單功效腺病毒具有更強(qiáng)的腫瘤抑制作用.
　　4.溶瘤腺病毒抗血管、誘導(dǎo)凋亡的病理學(xué)觀察:肝癌移植瘤治療后,CD34免疫組織化學(xué)標(biāo)記間質(zhì)血管、TUNEL法標(biāo)記細(xì)胞凋亡.結(jié)果顯示,溶瘤腺病毒CNHK500-shRNA-mE在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖并高效表達(dá)mE和shRNA,不但能夠抑制間質(zhì)腫瘤血管新生,而且大量誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡(圖5).對照組MVD為35.6士6.2,與之比較,CNHK500-shRNA-mE組MVD減少明顯(11.5士3.8,P<0.07),其次是CNHK500-mE(23.7士10.4,P<0.O5)和Ad-mE組(29.8士8.4,P<0.O5).CNHK500一*hRNA-mE、CNHK500-shRNA,CNHK500-mE,Ad-mE組凋亡率分別為(26.3士7.5)%,(21.6士5.3)%,(9.s士3.6)%,(6.6士2.g)%,而對照組凋亡率為(5.2士1.5)%)與對照組凋亡率比較,CNHK500-shRNA-mE和CNHK500-shRNA組差異有統(tǒng)計一學(xué)意義(P<0.0l),CNHK500-mE組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而Ad-mE組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).
　　討論
　　1.腫瘤細(xì)胞Survivin的表達(dá)及其對細(xì)胞凋亡的影響:Survivin是一種凋亡抑制基因,是目前發(fā)現(xiàn)強(qiáng)的凋亡抑制因子,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān).很多實驗證實,Survivin在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān).Survivin直接作用半眺氨酞天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase),主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性;Survivin也可通過p21間接抑制Caspase,阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C(CyclinC),抑制細(xì)胞凋亡.
　　通過抑制癌細(xì)胞Survivin表達(dá),能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,抑制癌細(xì)胞增殖,因此Survivin是腫瘤靶向治療的一個很有前景的靶標(biāo).
　　2.腫瘤間質(zhì)血管對腫瘤的意義及其抗血管治療策略:惡性腫瘤的快速生長和轉(zhuǎn)移能力離不開豐富的血供,腫瘤間質(zhì)血管新生的過程在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用.因此,抗血管生成治療成為腫瘤治療的輔助手段.1997年,科學(xué)家從小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤的培養(yǎng)上清中提取出的一種新的強(qiáng)效血管生成抑制因子,命名為內(nèi)皮抑素,它由內(nèi)生性膠原XVl}浚基端的183個氨基酸殘基構(gòu)成,內(nèi)皮抑素可抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá),可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,特異J勝地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移,減少腫瘤血管的生成,從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移.內(nèi)皮抑素可用于腫瘤的治療,其聯(lián)合經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)治療原發(fā)性肝癌,能減少腫瘤血供、提高TALE的療效,改善肝癌患者的整體生存時間和生活質(zhì)量,是原發(fā)性肝癌治療學(xué)重要的發(fā)展方向.
　　

　　3.本課題構(gòu)建的雙調(diào)控雙功效溶瘤腺病毒對肝癌的治療療效:溶瘤腺病毒作為基因治療的載體,已越來越受到重視〔8-9].我們前期構(gòu)建了針對腫瘤細(xì)胞高表達(dá)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和缺氧誘導(dǎo)因子一1(HIF-1)的腫瘤特異性增殖型腺病毒CNHK500,該腺病毒由hTERT啟動子調(diào)控腺病毒早期增殖基因Ela表達(dá),HIF-1調(diào)控序列區(qū)缺氧反應(yīng)元件(HRE)調(diào)控早期增殖基因Elb表達(dá),使其在雙啟動子的調(diào)控下實現(xiàn)其對癌細(xì)胞的特異性殺傷和溶解作用,又稱溶瘤腺病毒.
　　以此雙調(diào)控溶瘤腺病毒為載體,攜帶小鼠mE,抑制腫瘤間質(zhì)血管生成,達(dá)到抑制腫瘤生長的目的.在裸鼠肝癌移植瘤模型中,我們觀察到腺病毒的增殖和mE的表達(dá),但腫瘤的抑制在停止治療后呈恢復(fù)性生長,其主要原因是癌巢周邊彌散性血供提供營養(yǎng),使癌細(xì)胞增殖活性得到加強(qiáng).
　　我們將在前期研究的基礎(chǔ)上,聯(lián)合Survivin基因shRNA和mE的作用,構(gòu)建了雙調(diào)控雙功效溶瘤腺病毒,既能抑制癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,又可以抑制腫瘤血管新生,達(dá)到進(jìn)一步提高肝癌基因治療療效的目的.本實驗結(jié)果證實,新構(gòu)建的雙調(diào)控雙功效溶瘤腺病毒能夠在肝癌細(xì)胞中增殖,并高效表達(dá)mE,同時能有效沉默Survivin表達(dá),發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用.我們通過肝癌裸鼠移植瘤模型實驗,證實同時攜帶shRNA和mE的雙功效溶瘤腺病毒CNHK500-shRNA-mE比任一單功效腺病毒具有更強(qiáng)的腫瘤抑制作用.
　　參考文獻(xiàn) 　　Xu C,Sun Y,Wang Y. CEA promoter-regulated oncolytic adenovirus-mediated Hsp70 ex[x]pression in immune gene therapy for pancreatic cancer[J].Cancer Letters,2012.154-163.
　　Diaconu I,Cerullo V,Hirvinen ML. Immune response is an important aspect of the antitumor effect produced by a CD40L-encoding oncolytic adenovirus[J].Cancer Research,2012.2327-2338.
　　孫立臣,潘旭波,周先亭. 雙靶向溶瘤腺病毒攜帶內(nèi)皮抑素基因?qū)Ω伟┑囊种谱饔肹J].中華實驗外科雜志,2012,(8):1529-1531.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.08.038.
　　孫立臣,張柏和,張琪. 新型增殖型腺病毒CNHK500-hγ對肝癌細(xì)胞的殺傷作用[J].中國腫瘤生物治療雜志,2011,(6):635-640.doi:10.3872/j.issn.1007-385X.2011.06.009.
　　Chen Z,Liu N,Zhu G. Targeting of the anti-apoptotic gene survivin in human thyroid carcinoma[J].International Journal of Molecular Medicine,2012.465-472.
　　Chen XQ,Yang S,Li ZY. Effects and mechanism of downregulation of survivin ex[x]pression by RNA interference on proliferation and apoptosis of lung cancer cells[J].Mol Med Report,2012.917-922.
　　Cao H,Hu Y,Wang P. Down-regulation of Notch receptor signaling pathway induces caspase-dependent and caspase-independent apoptosis in lung squamous cell carcinoma cells[J].Acta Pathologica,Microbiologica Et Immunologica Scandinavica,2012.441-450.
　　蔣冠,張凱,魏志平. 攜帶白細(xì)胞介素-24的增殖型腺病毒聯(lián)合放療誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡的研究[J].中華實驗外科雜志,2012,(3):547.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.03.071.
　　張明,吳鳳鵬,石金苓. 條件復(fù)制腺病毒Ad-MK聯(lián)合絲裂霉素對膀胱癌細(xì)胞的作用[J].中華實驗外科雜志,2012,(8):1633.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.08.083.