復(fù)元膠囊對(duì)衰老性骨關(guān)節(jié)炎模型兔血清氧自由基代謝及血液流變學(xué)的影響

作者：牟方政,李榮亨,張文亮,肖彩芝　　作者單位：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016

　　【摘要】目的觀察復(fù)元膠囊對(duì)衰老性骨關(guān)節(jié)炎模型兔血清總超氧化酶歧化物(TSOD)、丙二醛(MDA)以及血液流變的影響。方法 52只健康新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常組、模型對(duì)照組、模型組、奧泰靈組、復(fù)元膠囊低劑量組、復(fù)元膠囊中劑量組及復(fù)元膠囊高劑量組。模型對(duì)照組右后肢伸直石膏固定，模型組在模型對(duì)照組基礎(chǔ)上頸背部皮下注射D半乳糖。各藥物組用灌胃方式給藥6 w。酶標(biāo)儀檢測(cè)血清TSOD和MDA光密度，計(jì)算TSOD活力和MDA濃度。全自動(dòng)血液流變分析儀測(cè)全血黏度。結(jié)果 造模6 w后，模型組與模型對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)典型骨關(guān)節(jié)炎病理改變。模型組血清TSOD活力降低和MDA濃度升高，與正常組和模型對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與正常組比較，血黏度指標(biāo)不同程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。用藥6 w后，復(fù)元膠囊各組與模型組比較，軟骨病理改變減輕，TSOD活力增強(qiáng)，MDA濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);血黏度指標(biāo)變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)元膠囊高劑量組與低、中劑量比較，TSOD和MDA變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 復(fù)元膠囊不能改善模型兔血液黏度，但能夠抑制氧自由基過(guò)度生成，起到延緩衰老，保護(hù)軟骨的作用。
　　【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;補(bǔ)腎;益氣活血;復(fù)元膠囊;氧自由基;血液流變
　　【Abstract】 ob[x]jective To observe the influence of Fuyuan capsule on serum total superoxide dismutases (TSOD) and malondialdehyde (MDA), hemorheology in replicative senescence osteoarthritis model rabbit. Further to explore the therapeutic mechanism of osteoarthritis by Fuyuan capsule. Methods Fiftysix healthy New Zealand big rabbits were randomly divided into normal, model control , model, glucosamine hydrochloride , different dose Fuyuan capsule groups. In model control group, the right hind limbs were fixed by plaster bandage in the straight situation. The model group was established by cervicodorsal hypodermic Dgalacitiol on the basis of model control group. Drug groups were respectively fed with glucosamine hydrochloride and Fuyuan capsule one times daily for six weeks. Serum TSOD level and MDA light density were detected by microplate reader, then the activity and concentration were calculated. Whole blood viscosity were tested with automatic measurement of blood rheology analyzer. Results After six weeks, in model and model control groups, the characteristics of osteoarthritis pathological changes of articular cartilage were seen. Compared with those of normal and model control groups, the serum TSOD activity of model group was reduced and MDA concentration was increased (P<0.05). There was significant difference in blood viscosity indexes between normal group and model group(P<0.05). The difference had statistical significance between different dose Fuyuan capsule groups and model group in the cartilage pathological changes. Compared with that of model group, the serum TSOD activity was increased, while the contents of MDA was lowered markedly after therapy in Fuyuan capsule groups (P<0.05). There was not statistical significance in the change of blood viscosity indexes between Fuyuan capsule groups and model group (P>0.05). The levels of TSOD and MDA in Fuyuan capsule highdosage group had statistical significance with lowdosage and middledosage groups (P<0.05).Conclusions Fuyuan capsules can not improve blood viscosity, but can inhibit overproduction of oxygen free radical, retard aging, play an important role in the prevention and treatment of osteoarthritis.

　　【Key words】 Osteoarthritis;Nourishing kidney; Enriching qi and activating blood; Fuyuan capsules; Free radicals; Hemorheology

　　骨關(guān)節(jié)炎(OA)是老年人常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病和慢性致殘的主要因素，OA的病因十分復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制未明，且缺乏有效治療手段。OA患者體內(nèi)存在氧自由基含量和血黏度變化，目前普遍認(rèn)為用中藥復(fù)方制劑清除體內(nèi)過(guò)剩氧自由基，降低血液黏度，為防治衰老性O(shè)A提供了研究途徑。前期研究表明〔1，2〕，復(fù)元膠囊具有抑制炎癥細(xì)胞因子、軟骨細(xì)胞凋亡的作用。本文采用皮下注射D半乳糖聯(lián)合右后肢膝關(guān)節(jié)伸直石膏固定法制作衰老性膝關(guān)節(jié)OA兔模型，檢測(cè)模型兔血清氧自由基清除劑總超氧化物歧化酶(TSOD)活力、毒性代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)濃度以及血液黏度，探討復(fù)元膠囊防治膝關(guān)節(jié)OA的其他作用機(jī)制。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料

　　1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　健康新西蘭兔(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)52只，雌雄各半，體重(2.5±0.5) kg。合格證：SCXK(渝) 20090001。
　　1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

　　實(shí)驗(yàn)藥物復(fù)元膠囊由鹿茸、淫羊藿、生曬參、黃芪、丹參等組成，重慶希爾安藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，科研批號(hào)(2005B18)。每粒膠囊重0.41 g，相當(dāng)于生藥3 g，僅供實(shí)驗(yàn)使用。對(duì)照藥物奧泰靈由香港澳美制藥公司生產(chǎn)(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20081011)，規(guī)格為每粒含鹽酸氨基葡萄糖750 mg。
　　1.1.3 主要儀器

　　酶標(biāo)儀(Thermo Scientific 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀)、微量移液器、水浴箱、冰箱、離心機(jī)、試管，全自動(dòng)血液流變測(cè)定儀、真空抗凝采血管,光學(xué)顯微鏡。以上儀器由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬一院中心實(shí)驗(yàn)室提供。
　　1.1.4 主要試劑

　　冰醋酸、無(wú)水乙醇、雙蒸水由實(shí)驗(yàn)室提供。SOD試劑盒(2009001) 和MDA試劑盒(2009002)均由南京建成生物工程研究所提供。D半乳糖由美國(guó)Amerisco公司提供。
　　1.2 方法

　　1.2.1 分組

　　52只新西蘭兔隨機(jī)分為正常組、模型對(duì)照組、模型組、奧泰靈對(duì)照組、復(fù)元膠囊低劑量組、復(fù)元膠囊中劑量組、復(fù)元膠囊高劑量組。每只均單籠飼養(yǎng)。動(dòng)物分組以及飼養(yǎng)方法。見(jiàn)表1。表1 動(dòng)物分組以及飼養(yǎng)方法

　　1.2.2 造模

　　所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同等條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，模型對(duì)照組采用伸直制動(dòng)法建?！?〕：先剪去兔子右后肢踝關(guān)節(jié)以上的兔毛，用醫(yī)用紗布裹上兩層，再用管型石膏將其伸直位固定，石膏外以透明膠紙封好，以防兔撕咬，若石膏松動(dòng)或脫落者及時(shí)重新固定，時(shí)間6 w，造成單純性O(shè)A模型。模型組在模型對(duì)照組的基礎(chǔ)上頸背皮下注射D半乳糖30 mg·kg-1·d-1，時(shí)間6 w，造成衰老性〔4〕OA模型。
　　1.2.3 給藥

　　造模后第1周開(kāi)始分組給藥。根據(jù)MeehRuber公式計(jì)算兔的給藥劑量，飲用水溶解后灌胃，均每日定時(shí)一次性給藥，用藥6 w。
　　1.2.4 觀察指標(biāo)

　　1.2.4.1 一般情況
　　觀察兔子精神狀況、毛發(fā)、局部淤血輕重及關(guān)節(jié)靈活度等。
　　1.2.4.2 SOD活力和MDA濃度檢測(cè)
　　用藥6 w后取標(biāo)本：將兔斷頸處死取血2 ml，經(jīng)4 000 r/min離心后，取血清于-20℃低溫冰箱中保存待測(cè)。采用羥胺法測(cè)定SOD活力，硫代巴比妥(TBA)法測(cè)MDA濃度。按SOD測(cè)定試劑盒步驟說(shuō)明操作，確定有效取樣量為10 μl，待測(cè)樣在波長(zhǎng)550 nm光下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)，根據(jù)公式測(cè)定TSOD活力=〔(對(duì)照管光密度-測(cè)定管光密度)÷對(duì)照管光密度〕×662 U/ml。按MDA測(cè)定試劑盒步驟說(shuō)明操作,取血清0.1 ml，待測(cè)樣在波長(zhǎng)532 nm光下用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度(A)，根據(jù)公式MDA濃度=〔(測(cè)定管光密度-測(cè)空管光密度)/(標(biāo)準(zhǔn)管光密度-標(biāo)空管光密度)〕×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/L)，計(jì)算MDA濃度。
　　1.2.4.3 血液黏度檢測(cè)
　　用真空抗凝管取血3 ml，輕輕搖動(dòng)采血管。在相同外界條件下，即時(shí)送檢。采用全自動(dòng)血液流變分析儀，檢測(cè)各組全血黏度高切(mpas200/s)、全血黏度低切(mpas3/s)、紅細(xì)胞剛性指數(shù)(TK)、紅細(xì)胞電泳時(shí)間(tRBC)。
　　1.2.4.4 組織學(xué)檢查
　　用藥6 w后，處死家兔，立即切取家兔脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)面的完整軟骨及軟骨下骨組織標(biāo)本，用10%的甲醛溶液固定48 h，脫鈣2～3 d，石蠟縱向包埋固定，常規(guī)切片，蘇木素伊紅(HE)染色。在光學(xué)顯微鏡下鏡檢各組動(dòng)物的病理切片，觀察軟骨的病理改變。
　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，單因素方差分析，兩組間比較用q檢驗(yàn)。
　　2 結(jié) 果
　　2.1 一般情況
　　模型對(duì)照組和模型組較正常組精神差，毛發(fā)光澤度下降，關(guān)節(jié)活動(dòng)不利，制動(dòng)右后肢局部不同程度淤血。奧泰靈組與模型組無(wú)明顯差別。復(fù)元膠囊各組較模型組精神好，活潑愛(ài)動(dòng)，毛發(fā)光澤度尚好，關(guān)節(jié)靈活度增大，淤血明顯減輕。
　　2.2 病理切片觀察

　　肉眼觀察正常組膝關(guān)節(jié)面光滑呈淡藍(lán)色;模型對(duì)照組和模型組動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨面不光滑，顏色暗淡，呈磨砂玻璃樣;奧泰靈組關(guān)節(jié)軟骨面欠光滑，顏色灰暗;復(fù)元膠囊各組關(guān)節(jié)軟骨面淡紅，比較光滑，高劑量組尤甚。病理切片采用HE染色，觀察發(fā)現(xiàn)正常組動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列均勻，無(wú)增生，軟骨面光滑;模型對(duì)照組和模型組關(guān)節(jié)軟骨切線層大部分缺失，移行層受損，軟骨細(xì)胞排列不均，并大量簇聚，毛細(xì)血管侵入軟骨下骨并部分突破潮線。奧泰靈組軟骨切線層破壞，細(xì)胞簇聚，雙重潮線。復(fù)元膠囊各劑量組軟骨表層比較規(guī)則，細(xì)胞排列相對(duì)均勻，散在肥大，且高劑量組較低劑量佳。
　　2.3 各組TSOD活力及MDA濃度比較

　　模型對(duì)照組與正常組比較，TSOD活力降低，MDA濃度升高(P<0.05)。模型對(duì)照組與模型組比較，TSOD活力、MDA濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)元膠囊各劑量組與模型組和奧泰靈組比較，TSOD活力升高，MDA濃度降低(P<0.05)。復(fù)元膠囊高劑量與低劑量比較，TSOD活力升高，MDA濃度降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。表2 各組血清TSOD活力、MDA濃度比較

　　2.4 各組血液黏度比較
　　模型對(duì)照組與正常組比較，反映紅細(xì)胞聚集能力的低切黏度和紅細(xì)胞電泳時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與模型對(duì)照組比較，反映紅細(xì)胞變形能力的高切黏度和紅細(xì)胞剛性指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與正常組比較全血黏度都升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)元膠囊各組與模型組比較，血黏度變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)元膠囊中劑量組與低、高劑量組比較，反映紅細(xì)胞聚集能力的指標(biāo)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。表3 各組血液黏度比較
　　3 討 論
　　3.1 造模評(píng)價(jià)

　　OA系多種病因所致關(guān)節(jié)軟骨的退行性變，與衰老和運(yùn)動(dòng)失度關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)采用伸直制動(dòng)兔右后肢，讓其運(yùn)動(dòng)不足，并結(jié)合頸背部皮下注射D半乳糖，制作衰老性O(shè)A模型。皮下注射D半乳糖制作衰老模型，廣泛用于藥物防治衰老的實(shí)驗(yàn)研究。有研究表明〔4〕皮下注射D半乳糖6 w后可以造成亞急性衰老模型，動(dòng)物血清和紅細(xì)胞中SOD活力下降，MDA濃度增加，可用于抗氧化等方面的抗衰老藥效研究。關(guān)節(jié)伸直制動(dòng)造成單純性O(shè)A模型，更能夠反映OA形成的自然屬性。紀(jì)斌平〔5〕等認(rèn)為膝關(guān)節(jié)伸直制動(dòng)，改變了關(guān)節(jié)的力學(xué)和生物學(xué)平衡，引起關(guān)節(jié)軟骨的破壞和代償性修復(fù)、增生，這可能是制動(dòng)造模的原理所在。張洪等〔6〕將28只成年新西蘭大白兔的左后肢膝關(guān)節(jié)伸直位石膏管形固定，觀察其左后肢膝關(guān)節(jié)軟骨病理改變。結(jié)果顯示6 w后無(wú)論從大體還是鏡下以及細(xì)胞凋亡情況，兔左后肢膝關(guān)節(jié)均呈典型的OA特征，因此認(rèn)為膝關(guān)節(jié)伸直位制動(dòng)5～6 w是一個(gè)制作OA動(dòng)物模型的較為理想的方法。在單純性O(shè)A基礎(chǔ)上增加衰老因素，采用這種方式造模6 w后，模型組軟骨符合OA病理改變，同時(shí)整體抗氧化能力也下降，說(shuō)明這種造模方法基本符合臨床OA的發(fā)生機(jī)理，誘導(dǎo)成功率高，應(yīng)用廣泛，特別適用于對(duì)預(yù)防或減輕衰老性O(shè)A的藥物研究。
　　3.2 自由基與OA OA是一種與衰老密切相關(guān)的疾病。目前研究認(rèn)為衰老的主要理論是自由基損傷學(xué)說(shuō)，自由基的過(guò)度生成，造成細(xì)胞、組織、器官損傷，出現(xiàn)功能衰退現(xiàn)象。自由基對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的損傷主要表現(xiàn)在對(duì)軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)損傷兩個(gè)方面。有研究〔7，8〕認(rèn)為OA病理狀態(tài)下血清和關(guān)節(jié)液氧自由基含量增高，過(guò)量的氧自由基可抑制軟骨細(xì)胞的增殖，引起軟骨細(xì)胞死亡，抑制軟骨基質(zhì)蛋白多糖和膠原的合成，加速軟骨基質(zhì)的降解，導(dǎo)致軟骨損傷。SOD活力的高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力，MDA濃度的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。二者可作為動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)衰老性疾病防治效果的客觀指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中結(jié)果表明，在模型組和模型對(duì)照組中血清TSOD活力降低，血清MDA濃度升高，說(shuō)明自由基參與了衰老性O(shè)A整個(gè)疾病過(guò)程。
　　3.3 血液黏度與OA 血黏度指標(biāo)中，全血高切、紅細(xì)胞剛性指數(shù)反映紅細(xì)胞的變形性;全血低切黏度、紅細(xì)胞電泳時(shí)間反映紅細(xì)胞的聚集性。OA血液循環(huán)狀態(tài)不良，局部瘀血或缺血，影響軟骨細(xì)胞的增殖，基質(zhì)合成減少，也是加速軟骨退變的重要原因。楊霖等〔9〕對(duì)OA患者采用多因素分析平衡年齡和性別因素后，結(jié)果顯示膝關(guān)節(jié)OA組的紅細(xì)胞變形指數(shù)和剛性指數(shù)高于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)采用伸直制動(dòng)辦法，可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部瘀血或缺血，這也會(huì)影響到軟骨營(yíng)養(yǎng)供給，促成OA模型形成。實(shí)驗(yàn)表明，模型對(duì)照組存在紅細(xì)胞聚集性增強(qiáng)，這一結(jié)果與人膝關(guān)節(jié)OA血黏度存在不一致的地方，可能與實(shí)驗(yàn)對(duì)象和影響因素有關(guān)，就其原因還有待于進(jìn)一步研究。模型組與模型對(duì)照組比較，全血高切值和剛性指數(shù)升高，說(shuō)明D半乳糖影響單純性O(shè)A血清紅細(xì)胞變形能力。模型組較模型對(duì)照組兔血液黏度各指數(shù)值都增加,說(shuō)明衰老性O(shè)A存在高黏血狀態(tài)。
　　3.4 復(fù)元膠囊治療OA OA相當(dāng)于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“骨痹”“痿癥”范疇。中醫(yī)認(rèn)為本病的發(fā)生多由于肝腎虧虛，氣血不足，風(fēng)寒濕邪侵入骨骼，以致血瘀阻經(jīng)絡(luò)，運(yùn)行失暢所致。衰老性O(shè)A病機(jī)以肝腎虧虛為本，血脈不利為標(biāo)。治宜補(bǔ)益肝腎，益氣活血。復(fù)元膠囊由鹿茸、淫羊藿、丹參、生曬參、黃芪等中藥經(jīng)科學(xué)配伍而成，具有益腎壯骨、行氣活血之效。有文獻(xiàn)報(bào)道〔10～12〕，鹿茸、淫羊藿、黃芪、丹參能夠清除機(jī)體過(guò)量自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物生成，起到抗氧化，延緩衰老性疾病的作用。本實(shí)驗(yàn)證明復(fù)元膠囊能夠增強(qiáng)衰老性O(shè)A血清TSOD的活力，降低MDA濃度，并且存在劑量依賴(lài)性。復(fù)元膠囊對(duì)衰老性O(shè)A兔血液黏度指標(biāo)總體上無(wú)明顯改善，甚至還有加重的趨勢(shì)。不過(guò)，隨著復(fù)元膠囊劑量加大，反映紅細(xì)胞聚集性的指標(biāo)出現(xiàn)先升高后降低，這說(shuō)明復(fù)元膠囊對(duì)紅細(xì)胞聚集狀態(tài)有雙向調(diào)節(jié)作用，這種原因可能與復(fù)元膠囊以補(bǔ)腎為主，活血力量偏弱有關(guān)，其具體作用機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。相反，這或許應(yīng)用于低黏血癥，能夠起到很好的療效。
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