幾丁糖-膠原-得寶松緩釋凝膠防止周?chē)窠?jīng)粘連的實(shí)驗(yàn)研究

     作者：陳維波，蘭麗琴，繆道一，朱 其 作者單位：325200 浙江瑞安，瑞安市人民醫(yī)院手外科

　　【摘要】 目的 評(píng)價(jià)周?chē)窠?jīng)損傷后，神經(jīng)縫合口局部應(yīng)用幾丁糖-膠原-得寶松緩釋凝膠抑制瘢痕增生、促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。方法 45只成年雄性SD大鼠隨機(jī)為三組(A 組:單純神經(jīng)縫合組;B組: 單純縫合+幾丁糖-膠原組;C組: 單純縫合+幾丁糖-膠原-得寶松組)，每組15只。分別術(shù)后4、8、12 周行大體觀察、組織學(xué)檢查、神經(jīng)電生理檢查和圖像分析。結(jié)果 單純縫合+幾丁糖-膠原-得寶松組神經(jīng)吻合口局部瘢痕增生和粘連程度較其他組明顯減輕，再生神經(jīng)纖維較直，排列結(jié)構(gòu)較整齊;電生理檢查12周后，CMAP明顯優(yōu)于其他組。結(jié)論 幾丁糖-膠原-得寶松凝膠能有效防止周?chē)窠?jīng)修復(fù)后局部瘢痕增生和粘連的形成，提高神經(jīng)功能恢復(fù)。

　　【關(guān)鍵詞】 幾丁糖-膠原;得寶松;神經(jīng)再生;瘢痕

　　【Abstract】 ob[x]jective To investigate the preventive effect of Chitolsan-collagen diprospan gel on scar formation following peripheral nerve injuries.Methods The right tibial nerve of 45 SD-rats were transected,immediately repaired and then randomly divided into three groups: A (control group),B(treated with Chitolsan-collagen gel) and C(treated with Chitolsan-collagen diprospan gel).At 4 weeks,8 weeks and 12 weeks after surgery procedure,general observation,electrophysiological study and immunological labeling were performed.Results Scarring formation in C group was significantly less than B and A group.CMAP of C group was remarkably higher than B and A group,which seemed to be paralleled with general observation.Further,immunological labeling showed that neuronal fibers were lined orderly in C group.Conclusion Chitolsan-collagen diprospan gel was effective in reducing scar formation and enhancing peripheral nerve regeneration.

　　【Key words】 Chitosan-collagen gel; Diprospan; Nerve regeneration; Scar

　　應(yīng)用顯微縫合技術(shù)修復(fù)周?chē)窠?jīng)損傷是目前臨床上常用的方法，但是單純縫合后由于炎癥反應(yīng)等造成局部瘢痕組織增生粘連直接影響了神經(jīng)修復(fù)的效果[1,2]。瘢痕組織主要通過(guò)兩種方式影響神經(jīng)功能的恢復(fù)，一是與損傷神經(jīng)粘連,直接壓迫神經(jīng);二是瘢痕生長(zhǎng)入縫合口間隙，阻礙近端再生的神經(jīng)纖維通過(guò)縫合口。幾丁糖-膠原復(fù)合膜是一種具有緩釋功能的可降解材料[3]。本課題以大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，將長(zhǎng)效甾體類(lèi)激素得寶松加入幾丁糖-膠原凝膠中，并將其應(yīng)用于神經(jīng)縫合口周?chē)?，達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。

　　1 材料與方法

　　1.1 幾丁糖-膠原-得寶松緩釋放系統(tǒng)制備

　　取3%酸溶性幾丁糖(上海其勝生物制劑有限公司)與1.5%膠原(Sigma公司)以1：9的比例混合,再逐漸加入得寶松(Schering-Plough Labo N.v.,Belgium)混懸液，濃度為1ml，充分混合60min，經(jīng)特殊工藝制成幾丁糖-膠原-得寶松緩釋凝膠，4℃下存放。

　　1.2 動(dòng)物與分組

　　選用SD(中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供))大鼠45只,雄性,體重150g左右。隨機(jī)分為三組。A 組:單純神經(jīng)縫合組;B組: 單純縫合+幾丁糖-膠原組;C組: 單純縫合+幾丁糖-膠原-得寶松組。每組15只大鼠。

　　1.3 手術(shù)方法

　　大鼠以10g/L戊巴比妥鈉(40mg/ kg)腹腔注射麻醉,俯臥位固定。取大鼠股后部斜切口，分開(kāi)臀肌，在放大6倍的手術(shù)顯微鏡下解剖脛神經(jīng)，于膝關(guān)節(jié)上緣5mm處切斷脛神經(jīng)，以神經(jīng)外膜上血管走行為標(biāo)記，9-0無(wú)損傷線縫合神經(jīng)外膜6針，針距與邊距大小以使軸突不膨出、外膜不內(nèi)翻為宜。A 組:神經(jīng)切斷后直接縫合;B 組: 神經(jīng)切斷后直接縫合，在吻合口10mm 的范圍內(nèi)注射幾丁糖-膠原凝膠;C組:神經(jīng)切斷后直接縫合，在吻合口10mm 的范圍內(nèi)注射幾丁糖-膠原-得寶松緩釋凝膠。

　　1.4 檢測(cè)指標(biāo)

　　術(shù)后4、8、12 周分別檢測(cè)下列項(xiàng)目。

　　1.4.1 大體觀察

　　取材時(shí)切開(kāi)傷口觀察皮膚、肌肉和筋膜愈合情況，神經(jīng)吻合口與周?chē)∏幌墩尺B情況，幾丁糖-膠原在體內(nèi)降解吸收情況。

　　1.4.2 電生理檢查

　　術(shù)后4、8、12 周,麻醉方法同上。顯露手術(shù)側(cè)脛神經(jīng),用意大利ESAOTE 公司的Phasis四道程肌電誘發(fā)儀檢測(cè)。在神經(jīng)近端刺激,腓腸肌記錄并計(jì)算運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位波幅。

　　1.4.3 組織學(xué)檢測(cè)

　　以脛神經(jīng)吻合為中心切取神經(jīng)約1cm,標(biāo)記后以體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定24h，梯度乙醇脫水,縱切面連續(xù)切片，厚約5μm，脛神經(jīng)冰凍切片貼片→0.01M PBS洗3次，每次10min→0.1%Triton破膜10min→0.01M PBS洗3次，每次10min→2%BSA室溫下封閉30min→去血清，加入 GAP43單克隆抗體(dilution 1:200; Abcam)，4℃過(guò)夜→0.01M PBS洗3次，加熒光二抗：IgG-CY3，室溫下避光作用2h→透明、封片、熒光顯微鏡下觀察并拍照(Axiocam MR R3,Carl Zeiss,Germany)。

　　1.4.4 計(jì)算機(jī)圖像分析

　　術(shù)后12周，經(jīng)縫合口遠(yuǎn)、近端橫切面做半薄切片，甲苯氨藍(lán)髓鞘染色。采用K-400圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算遠(yuǎn)端神經(jīng)軸突的平均直徑和有髓神經(jīng)纖維再生率。

　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　所有數(shù)據(jù)用(x±s)表示,實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)與對(duì)照組數(shù)據(jù)間用非配對(duì)t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

　　2 結(jié)果

　　2.1 傷口大體觀察

　　所有大鼠在麻醉下切開(kāi)傷口觀察皮膚、肌肉和筋膜愈合情況以及神經(jīng)吻合口與周?chē)M織的粘連情況(圖1)。術(shù)后4周，幾丁糖-膠原凝膠降解不明顯;術(shù)后8周，該凝膠明顯降解吸收;術(shù)后12周時(shí)該凝膠完全降解吸收。術(shù)后12周，A 組的神經(jīng)縫合口處增粗,與周?chē)M織粘連明顯;B 組的神經(jīng)縫合口處增粗，與周?chē)M織粘連不明顯;C組的神經(jīng)縫合口光滑與周?chē)M織無(wú)明顯粘連。

　　2.2 電生理檢測(cè)結(jié)果

　　見(jiàn)表1。術(shù)后4周B、C組的肌電檢測(cè)偶見(jiàn)電位,A組為電靜息。術(shù)后8周,刺激神經(jīng)遠(yuǎn)、近端及導(dǎo)管處,三組均出現(xiàn)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位,B、C組與A組相比，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和CMAP波幅的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B與C組無(wú)論是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度還是CMAP波幅的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);術(shù)后12周,B與C組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而CMAP波幅的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。表1 術(shù)后8、12周神經(jīng)電生理檢查結(jié)果比較

　　2.3 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

　　各組均有再生神經(jīng)纖維通過(guò)吻合口向遠(yuǎn)端生長(zhǎng)。C組縱切面上觀察有較多再生神經(jīng)纖維通過(guò)縫合口,神經(jīng)纖維較直，排列結(jié)構(gòu)較為整齊;B組縱切面上觀察有較多再生神經(jīng)纖維通過(guò)縫合口,部分神經(jīng)纖維扭曲，排列欠整齊;A組縱切面上見(jiàn)縫合口局部被瘢痕壓迫而有不同程度狹窄，通過(guò)縫合口的再生神經(jīng)纖維扭曲明顯，排列不整齊(圖3)。

　　2.4 計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果

　　術(shù)后12周，三組軸突的平均直徑和有髓神經(jīng)纖維再生率相比較發(fā)現(xiàn)，C組>B組>A組，差異有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表2。表2 術(shù)后12周計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果比較

　　3 討論

　　周?chē)窠?jīng)損傷是臨床上常見(jiàn)的損傷，修復(fù)的方法主要是顯微外科縫合。研究表明，周?chē)窠?jīng)損傷后的再生是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，受到局部甚至整體多種因素的影響[4]。顯微縫合后神經(jīng)縫合口處瘢痕組織的增生和局部與周?chē)M織的粘連不僅影響局部的微循環(huán)，而且瘢痕早期可阻礙再生軸突向遠(yuǎn)端延伸，晚期又可能牽拉壓迫周?chē)窠?jīng)，造成神經(jīng)纖維排列結(jié)構(gòu)紊亂，是影響周?chē)窠?jīng)修復(fù)后功能恢復(fù)的主要因素之一[5]。單純應(yīng)用各種促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的藥物或其他手段，往往不能獲得理想的效果。這是目前周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)亟待解決的難題。因此,研究預(yù)防周?chē)窠?jīng)術(shù)后的瘢痕增生，提高周?chē)窠?jīng)修復(fù)療效，改善功能恢復(fù)，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

　　目前研究主要集中在兩方面[6～8]，一是利用生物制劑阻隔神經(jīng)縫合口和周?chē)M織以達(dá)到物理防粘連的效果;二是利用一些甾體類(lèi)激素抑制炎癥反應(yīng)的藥理作用以達(dá)到防止瘢痕增生的效果。但總體效果均不令人滿意。迄今為止，將這兩方面結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，使得物理阻隔和藥理作用能持久、地同時(shí)發(fā)揮，促進(jìn)神經(jīng)再生的作用，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。

　　幾丁糖(Chitosan)具有較好的組織相容性，極強(qiáng)的生物活性，良好的生物降解性。不同濃度的幾丁糖及其衍生物一方面促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，有利于新生修復(fù)組織的結(jié)構(gòu)重塑和構(gòu)建，能增強(qiáng)或恢復(fù)傷口愈合的力學(xué)強(qiáng)度;另一方面抑制成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖，防止瘢痕增生，有助于外觀和功能的恢復(fù)，使傷口得到高質(zhì)量的愈合。因此，可以作為局部緩釋藥物的良好載體，有研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[9]，幾丁糖慶大霉素藥物釋放系統(tǒng)在治療骨感染方面具有較好的體內(nèi)、外緩釋作用，使用簡(jiǎn)單、方便、安全、無(wú)需二期取出。但是，幾丁糖在體內(nèi)降解需要較長(zhǎng)時(shí)間。

　　膠原(Collagen)具有生物可降解性、生物相容性和低免疫原性，已廣泛應(yīng)用于藥物載體系統(tǒng)和人造血管、瓣膜等組織工程領(lǐng)域。膠原可應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域的一個(gè)主要原因在于它經(jīng)過(guò)自聚和交聯(lián),可形成具有一定強(qiáng)度和穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu),用弱酸水提取后可制成多種形式的藥物載體系統(tǒng)。

　　隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，已可合成各種不同降解速度及力學(xué)性能的生物材料。同時(shí)，局部緩釋使藥物的安全性、有效性和適應(yīng)性都有所提高，該技術(shù)在抗炎及抗腫瘤等方面都顯示了其應(yīng)用價(jià)值[10～13]，在促進(jìn)神經(jīng)再生方面也已有了一些嘗試[14,15]。幾丁糖-膠原復(fù)合膜就是一種新型的生物可降解復(fù)合材料，既增加了材料的柔韌性,又可根據(jù)需要制備成不同降解時(shí)間的緩釋膜[16～18]。

　　本研究將幾丁糖-膠原制備成凝膠狀，方便臨床應(yīng)用，同時(shí)將長(zhǎng)效甾體類(lèi)激素得寶松加入這種幾丁糖-膠原凝膠中，應(yīng)用于神經(jīng)縫合口周?chē)?。一方面防止瘢痕組織長(zhǎng)入神經(jīng)縫合口，使更多的再生軸突通過(guò)縫合口，到達(dá)靶器官;另一方面通過(guò)緩慢、持續(xù)釋放甾體類(lèi)激素，可防止神經(jīng)周?chē)：墼錾瑴p少瘢痕組織對(duì)損傷神經(jīng)的卡壓及對(duì)血供的影響。結(jié)果顯示，應(yīng)用該凝膠后，神經(jīng)縫合口周?chē)：墼錾@著減少，與周?chē)M織粘連不明顯。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)再生神經(jīng)軸突數(shù)量高于其他兩組且排列較為整齊。電生理檢查顯示，在12周，CMAP的波幅高于其他兩組。

　　因此，筆者認(rèn)為：將加入得寶松的幾丁糖-膠原凝膠應(yīng)用于縫合后的神經(jīng),借助其物理隔離及緩慢釋放甾體激素的功能，使產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，可起到持久、恒定的瘢痕抑制作用，從而達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)再生、提高神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。為解決促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生這一難題提供了一種新的方法。