通過異型雙功能交聯(lián)劑N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡基二硫 )-丙酸酯 ( SPDP) 交聯(lián)的方法制備

作者：劉金華1，周　潔2，冷　靜3 作者單位：1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室;2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科;　3.廣西中醫(yī)學(xué)院( 廣西　南寧　530021)

　　【摘要】 目的：制備穿膜肽TAT-EGFP與白蛋白微球(BSA-NP)偶聯(lián)物，并檢測其對膀胱癌EJ細(xì)胞的穿膜活性。方法：穿膜肽TAT-EGFP與白蛋白微球偶聯(lián)物。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、電鏡、熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡檢測其共價連接及活性。結(jié)果：SDS-PAGE電泳鑒定TAT-EGFP與白蛋白微球是通過共價鍵連接;電鏡顯示二聯(lián)偶聯(lián)物(TAT-EGFP-BSA-NP)的構(gòu)象;熒光顯微鏡及電鏡顯示了二聯(lián)偶聯(lián)物的穿膜活性。結(jié)論：成功的制備穿膜肽TAT-EGFP與白蛋白微球偶聯(lián)物-TAT-EGFP-BSA-NP，且偶聯(lián)物對膀胱癌細(xì)胞有穿膜活性。

　　【關(guān)鍵詞】 穿膜肽;血清白蛋白微球;蛋白偶聯(lián);N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡基二硫 )-丙酸酯

　　Abstract：ob[x]jective：To prepare nanospheres coupled with cell-penetrating peptides(Cpps) and evaluate its ability to cross the plasma membrane of bladder cancer cell (EJ cell).Methods：The nanosphere coupled with TAT-EGFP was prepared by methods of crossli[x]nking via hetero-bifunctional cross-li[x]nker SPDP.Nanospheres and its penetrating activity were tested by SDS-PAGE electrophoresis，scanning electron microscopy and laser scanning confocal microscope (LSCM).Results：SDS-PAGE electrophoresis revealed the nanospheres li[x]nked covalently with TAT-EGFP.The penetrating activity of TAT-EGFP is preserved under scanning electron microscopy and LSCM.Conclusion：The preparation of TAT-EGFP-BSA-NP was succeeded.It was binded by covalent bond and it could penetrate EJ cell.

　　Key words：Cpps;nanosphere;protein-protein conjugation;SPDP

　　自1988年Green等[1,2]首先發(fā)現(xiàn)并證實人免疫缺陷病毒(HIV-1)的反式激活蛋白TAT具有跨膜轉(zhuǎn)移的功能后，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些具有細(xì)胞穿透功能的氨基酸序列，長度多數(shù)小于30個氨基酸，被命名為穿膜肽(cell-penetrating peptides CPPs)或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域( Protein transduction domains PTDs)，它們可以攜帶多種物質(zhì)，包括親水性蛋白、多肽、D N A甚至顆粒性物質(zhì)等進行細(xì)胞內(nèi)的傳輸，并且不受細(xì)胞類型的限制，關(guān)于穿膜肽的研究逐步成為熱點。微球是近年來發(fā)展的新型給藥體系，它既能保護藥物免遭破壞，又與某些細(xì)胞組織有特殊親和性人血清白蛋白毫微球是人體理想的藥物載體，是目前用于制備帶藥毫微球的主要材料之一。關(guān)于穿膜肽與蛋白毫微球偶聯(lián)物的制備及其活性鑒定的研究國內(nèi)尚未見有報道。本實驗利用分子量小、穩(wěn)定表達，并在自身發(fā)光過程中對各種細(xì)胞均無明顯毒害作用的增強型綠色熒光蛋白 ( enhanced green fluorescent protein，EGFP) 作為TAT的報告蛋白，采用異型雙功能連接劑SPDP偶聯(lián)穿膜肽與蛋白微球，并探討二聯(lián)偶聯(lián)物的活性。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要試劑和儀器

　　1.1.1　主要試劑

　　N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡基二硫 )-丙酸酯 ( SPDP) P3415-25mg為美國Sigma公司產(chǎn)品;二硫蘇糖醇(DTT)slbCB233155-1g為德國Merck公司產(chǎn)品;超濾離心管Amicon Ultral UFC901008 15ml,10K 為美國Millipore 公司產(chǎn)品;親和層析柱Ni-NTA Superflow Cartvidgekj30760 1]融合蛋白TAT-EGFP的大量表達、純化：應(yīng)用本課題組成功構(gòu)建的含重組表達質(zhì)粒Pet30a-TAT-EGFP的重組菌株BL21大量表達，用IPTG誘導(dǎo)，用pH=8.0的Tris裂解液以及超聲波處理器裂菌，4℃、8000r/min,20min離心后留上清通過親和層析柱Ni-NTA Superflow Cartvidge純化，用同方法制備綠色熒光蛋白EGFP以作對照。用SDS-PAGE鑒定其純度及分子量大小，制成干粉-20℃保存?zhèn)溆谩?br />
　　1.2.2　融合蛋白TAT-EGFP與白蛋白微球BSA-NP的偶聯(lián) 樣品處理原則及公式參照[3,4]，具體步驟如下：

　　步驟1：制備TAT-EGFP，BSA-NP的SPDP衍生物TAT-EGFP-PDP，BSA-NP-PDP 取適量的TAT-EGFP，BSA-NP溶于2ml 的0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS pH=7.5)中，按n(TAT-EGFP) /n(SPDP)=1/10，n(BSA-NP) / n(SPDP)=1/30的投料摩爾比值，計算所需要的SPDP量，先將其溶于無水乙醇中，然后于25 ℃緩慢將溶于乙醇的SPDP分別攪拌加入含有TAT-EGFP和BSA-NP的磷酸緩沖液中，繼續(xù)緩慢攪拌30min后，10000r/min 30s，之后分別處理TAT-EGFP，BSA-NP的SPDP衍生物：將TAT-EGFP與SPDP的反應(yīng)物離心后取上清放入超濾離心管，加入0.02 mol/L磷酸緩沖液(含0.15 mol/LNacl pH=7.5),3500g,4℃，離心15min，重復(fù)三次，以去除剩余的SPDP，即得TAT-EGFP-PDP，濃縮至2ml;將BSA-NP與SPDP的反應(yīng)物離心后取沉淀，用0.01 mol/L的醋酸鹽緩沖液( pH=4.5)1500 r/min 45s離心洗滌重復(fù)3次，去除剩余的SPDP，即得BSA-NP-PDP。留TAT-EGFP-PDP，BSA-NP-PDP100μl 用DTT法測定蛋白與SPDP摩爾比，并同時留樣做SDS-PAGE電泳。

　　步驟2：BSA-NP-PDP巰基衍生物的制備 將BSA-NP-PDP沉淀分散于上述醋酸鹽緩沖液中，加入DTT，使反應(yīng)體系中DTT的終濃度為50mmol/L,25 ℃緩慢攪拌30min后用0.02 mol/L磷酸緩沖液(含0.15 mol/LNacl pH=7.5)離心洗滌3次，以去除DTT并取代醋酸緩沖液，這一步驟得到BSA-NP-PDP巰基衍生物BSA-NP-SH。

　　步驟3：二聯(lián)偶聯(lián)物TAT-EGFP -BSA-NP的制備 將BSA-NP-SH用0.01 mol/LPBS懸浮，立即與TAT-EGFP-PDP混合，混合均勻后馬上測OD343的值，4℃緩慢攪拌反應(yīng)≥16h,12000 r/min 45s，取上清測定OD343的值，計算交聯(lián)產(chǎn)品的摩爾比。取沉淀用PBS離心洗滌4次，取沉淀即為二聯(lián)偶聯(lián)物TAT-EGFP -BSA-NP，用PBS混勻，于4℃保存。

　　步驟4：n(樣品) /n(SPDP) 偶聯(lián)產(chǎn)品摩爾結(jié)合比的測定 n(樣品) /n(SPDP)摩爾比采用DTT法。取100μl待測樣品，加人890μl 0.01 mol/L磷酸緩沖液( pH=7.5)，在343nm處測OD值;加人10μl新鮮配制的DTT，反應(yīng)15分鐘后，再測343nm處的OD值。由[5]可知產(chǎn)生1mol吡啶-2-硫酮，需要1mol的SPDP，已知吡啶-2-硫酮1 mol/L濃度在343nm的OD值為8.08×103，從反應(yīng)前后OD值的變化差，就可推算出吡啶-2-硫酮的濃度，進而得出參加反應(yīng)的SPDP的濃度?？捎萌缦鹿接嬎悴⑼ㄟ^ [4] 。

　　1.2.3　二聯(lián)偶聯(lián)物TAT-EGFP -BSA-NP鑒定

　　(1)二聯(lián)偶聯(lián)產(chǎn)物純度、成分的檢驗 偶聯(lián)產(chǎn)物分別進行非還原型和還原型SDS-PAGE凝膠電泳，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的分離膠、5%的濃縮膠，以檢驗偶聯(lián)產(chǎn)物的共價鍵連接以及偶聯(lián)結(jié)果和產(chǎn)物的純度;將偶聯(lián)產(chǎn)物制成懸液，送廣西醫(yī)科大學(xué)電鏡室進行掃描電子顯微鏡的觀察。

　　(2)二聯(lián)偶聯(lián)產(chǎn)物穿膜活性的鑒定 熒光顯微鏡觀察：將生長期的膀胱癌細(xì)胞(EJ細(xì)胞)用0.25%的胰蛋白酶消化下來，加入6孔板，每孔1×105個，培養(yǎng)24小時后用冰PBS洗滌3次，分為三組：1組實驗組，加適量的TAT-EGFP -BSA-NP二連偶聯(lián)物，用培養(yǎng)基補足1ml;2組陰性對照組，加等量的EGFP-BSA-NP偶聯(lián)物，用培養(yǎng)基補足1ml;3組空白對照組，只加1ml培養(yǎng)基。37℃，5%CO2共培養(yǎng)6個小時后，棄掉培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1000 r/min離心5min，棄上清;加培養(yǎng)基再次離心1000 r/min離心5min棄上清，以去除胰酶影響;用PBS懸浮細(xì)胞，置于熒光顯微鏡下觀察二聯(lián)偶聯(lián)物的穿膜活性。電子顯微鏡觀察：將生長期的EJ細(xì)胞加二聯(lián)偶聯(lián)物共作用10h后，用PBS清洗3次，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1000 r/min離心10min，形成細(xì)胞團塊，浸泡于固定液戊二醛中，送廣西醫(yī)科大學(xué)電鏡室進行透射電子顯微鏡的制片及觀察。

　　2　結(jié)果

　　2.1　蛋白表達產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果

　　圖1　重組質(zhì)粒pET30a-TAT-EGFP、pET30a-EGFP誘導(dǎo)表達、純化后SDS-PAGE分析M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker1.含pET30a+質(zhì)粒的BL21空白菌對照2.重組質(zhì)粒pET30a-TAT-EGFP未誘導(dǎo)表達3.重組質(zhì)粒pET30a-TAT-EGFPIPTG誘導(dǎo)表達4.重組質(zhì)粒pET30a-TAT-EGFP誘導(dǎo)表達裂菌后的沉淀5.重組質(zhì)粒pET30a-TAT-EGFP誘導(dǎo)表達裂菌后的上清6.重組質(zhì)粒pET30a-TAT-EGFP的上清純化后蛋白7.重組質(zhì)粒pET30a -EGFP上清純化后蛋白以轉(zhuǎn)入pET30a的BL21菌株以及IPTG誘導(dǎo)前的重組子為對照，收集大量表達裂菌后的上清及上清純化液，進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果分析如上圖1：純化后的蛋白TAT-EGFP，EGFP分子量分別在31kd,28kd 左右，沒有明顯的雜帶，與預(yù)期相符。

　　2.2　融合蛋白TAT-EGFP與白蛋白微球BSA-NP的偶聯(lián)結(jié)果

　　2.2.1　SPDP衍生物、偶聯(lián)產(chǎn)物的摩爾比值

　　本實驗所得到SPDP的衍生物的摩爾結(jié)合比分別是n(TAT-EGFP) /n(SPDP)=1 /?，n(BSA-NP) /n(SPDP)=1 /14.5，n(TAT-EGFP) /n(BSA-NP)= 1 /5;

　　2.2.2　偶聯(lián)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果

　　偶聯(lián)產(chǎn)物的非還原，還原SDS-PAGE結(jié)果如圖所示：圖2　偶聯(lián)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜M標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker;2.偶聯(lián)產(chǎn)物的非還原型SDS-PAGE;3.BSA-NP;4.TAT-EGFP;5.偶聯(lián)產(chǎn)物的非還原型SDS-PAGE偶聯(lián)產(chǎn)物的非還原型SDS-PAGE結(jié)果見圖3中的2。因為微球BSA-NP不能穿過SDS-PAGE膠，所以微球偶聯(lián)物也不能穿透SDS-PAGE膠。從圖中可以看到，產(chǎn)物中未見TAT-EGFP，BSA-NP條帶，說明產(chǎn)物偶聯(lián)完全，較均一，說明TAT-EGFP聯(lián)到了微球上，這與預(yù)期結(jié)果一致。偶聯(lián)產(chǎn)物的還原型SDS-PAGE結(jié)果見圖3中的5。同樣因為微球BSA-NP不能穿過SDS-PAGE膠，圖中可以看到只有TAT-EGFP的條帶，這與預(yù)期結(jié)果一致。以上結(jié)果說明偶聯(lián)是成功的。

　　2.2.3　電子掃描顯微鏡結(jié)果

　　二聯(lián)偶聯(lián)物電子掃描顯微鏡觀察結(jié)果見圖3，圖中可見微球光滑，圓球狀，分散性一般。圖3　偶聯(lián)物電子掃描顯微鏡觀察

　　2.2.4　偶聯(lián)產(chǎn)物穿膜活性結(jié)果

　　(1)熒光顯微鏡觀察二聯(lián)偶聯(lián)物的穿膜活性 照上述方法分3組，共作用6小時，熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖4所示，可見二聯(lián)偶聯(lián)物還保留其穿膜活性，與預(yù)期結(jié)果一致。圖4　熒光顯微鏡觀察偶聯(lián)產(chǎn)物的穿膜活性結(jié)果A.明場觀察;B.熒光顯微鏡熒光觀察行1.空白對照組(細(xì)胞對照);行2.陰性對照組(EGFP-BSA-NP);行3.實驗組(TAT-EGFP-BSA-NP)

　　3　討論

　　化療是腫瘤治療的主要方法之一，而如何提高化療藥物的療效并降低其一直是化療治療的關(guān)鍵。增加藥物的濃度可以提高藥物的療效但同時藥物的也加強，增加了病人的負(fù)擔(dān)。不過，自1988年發(fā)現(xiàn)TAT可以無毒方式穿透細(xì)胞生物膜以來，細(xì)胞穿膜肽CPPs就成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)CPPs可以通過化學(xué)結(jié)合或基因融合等方式攜帶蛋白質(zhì)、DNA、化學(xué)藥物、核苷酸、40nm磁珠和200nm脂質(zhì)體等各種生物大分子[5,6]穿透細(xì)胞生物膜和血腦屏障并且沒有細(xì)胞毒性，在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療學(xué)以及藥學(xué)等領(lǐng)域具有很大的研究價值。微球是近年來發(fā)展的新型給藥體系，它既能保護藥物免遭破壞，又與某些細(xì)胞組織有特殊親和性。毫微球是一類由天然或者合成高分子物質(zhì)制成的粒徑為10～1000nm的固體顆粒，可通過毛細(xì)血管，可以攜帶較多藥物，并具有緩釋性[7,8]。目前用于制備帶藥毫微球的材料很多。人血清白蛋白毫微球含有大量游離的羥基及氨基便于交聯(lián)，且結(jié)構(gòu)清楚、生物性能穩(wěn)定，并為人體自身白蛋白，不會增加過敏反應(yīng)，是人體理想的藥物載體[8]。如果將穿膜肽與化療藥物毫微球連接一方面利用穿膜肽的穿膜作用可以減少其穿膜時間;另一方面利用毫微球的緩釋作用增加藥物的有效作用時間，這樣既可以提高療效，又能降低化療藥物的，這對臨床治療具有重要意義。

　　本實驗中我們使用的交聯(lián)劑是異型雙功能偶聯(lián)劑具有專一、反應(yīng)溫和并容易控制反應(yīng)量的優(yōu)點，被廣泛用于蛋白質(zhì)的交聯(lián)偶聯(lián)物的制備。實驗中我們用SPDP將穿膜肽TAT-EGFP與白蛋白毫微球BSA-NP進行偶聯(lián)成功制備了二聯(lián)偶聯(lián)物TAT-EGFP -BSA-NP，并證明該二聯(lián)偶聯(lián)物是有活性的。我們制備的毫微球為比一般化療藥物更有療效的劇毒藥物提供了理想載體，我們制備的穿膜肽-毫微球藥物傳送系統(tǒng)對腫瘤治療開辟了新的思路。