腦膠質(zhì)瘤組織中PCNA和PTEN表達(dá)的意義

　作者：孟喜君,劉勇,王茂德,謝萬福　　作者單位：西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，解剖與組織胚胎學(xué)，陜西 西安 710061

　　【摘要】 目的：探討增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和第10號染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)差異的臨床意義. 方法：采用組織芯片技術(shù)建立96例腦膠質(zhì)瘤和22例正常腦組織的組織芯片，并用免疫組織化學(xué)Elivision法，分別檢測PTEN和PCNA在不同組織學(xué)類型和不同組織學(xué)分級的人腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)差異. 結(jié)果： PCNA和PTEN在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與在正常腦組織中的表達(dá)之間的差別有顯著意義; PTEN在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)陽性率45/78 (57.7%)顯著高于其在非星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)陽性率5/18 (27.8%)(P<0.05); PCNA在高分化腦膠質(zhì)瘤(組織學(xué)分級Ⅰ～Ⅱ級)中表達(dá)低于在低分化腦膠質(zhì)瘤(組織學(xué)分級Ⅲ～Ⅳ級)中表達(dá);隨著膠質(zhì)瘤惡性度增高,PTEN表達(dá)強(qiáng)度逐漸下降,PCNA的表達(dá)則呈上升趨勢. 結(jié)論：PCNA的表達(dá)反應(yīng)了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與分化的一般規(guī)律, PTEN表達(dá)的降低在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著非常重要的作用，PCNA和PTEN的聯(lián)合檢測有利于更準(zhǔn)確地判斷膠質(zhì)瘤生物行為和評估患者預(yù)后.

　　【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)瘤;增殖細(xì)胞核抗原;磷酸脂酶

　　Significance of PCNA and PTEN ex[x]pressions in glioma tissue

　　MENG XiJun, LIU Yong, WANG MaoDe, XIE WanFu

　　Department of Neurosurgery, First Affiliated Hospital,Department of Anatomy and Histoembryology, Medical School, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　【Abstract】 AIM: To investigate the clinical significance of the differential ex[x]pressions of PCNA and PTEN in glioma tissue and normal brain tissue. METHODS: Tissue microarray including 96 gliomas and 22 normal brain tissues was prepared. The ex[x]pressions of PCNA and PTEN in glioma tissue and normal brain tissue with different histological types and different histological grades were detected by Elivision method of immunohistochemistry. RESULTS: The positive ex[x]pression rates of PCNA and PTEN had significantly difference between glioma tissue and normal brain tissue (P<0.05). The ex[x]pression of PTEN was significantly higher in astrocytoma than in other types of glioma (P<0.05); the ex[x]pression of PCNA was significantly lower in welldifferentiated glioma than in poorly differentiated glioma, but the ex[x]pression of PTEN was significantly higher in welldifferentiated glioma than in poorly differentiated glioma; along with the malignant level of glioma rising up, the ex[x]pression intensity of PTEN decreased, and the ex[x]pression of PCNA increased. CONCLUSION: The ex[x]pression of PCNA mirrors the general rule of cell multiplication and differentiation of glioma. The decrease of the ex[x]pression of PTEN may have very important effect on development and growth of glioma. Combined detection of PCNA and PTEN can estimate the biological behaviour and prognosis of the patients more exactly.

　　【Keywords】 glioma; PTEN; PCNA

　　0 引言

　　腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的腫瘤之一，隨著腫瘤級別的增加，其惡性度也加大，對于惡性膠質(zhì)瘤目前尚無有效的治療手段，如何提高膠質(zhì)瘤患者的生存率一直是神經(jīng)外科界迫切需要解決的難題. 我們采用免疫組織化學(xué)方法，觀察增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和第10號染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10, PTEN)在不同性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型和組織學(xué)分級的腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)情況. 探討腦膠質(zhì)瘤組織中PCNA和PTEN表達(dá)的意義，旨在從蛋白水平研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病原因，為臨床尋找腦膠質(zhì)瘤的病因提供理論參考和依據(jù).

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 1997/2005西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腦膠質(zhì)瘤存檔蠟塊96(男45，女51)例;年齡14～77(平均46.5)歲，其中≤45歲者56例，>45歲者40例. 參照《WHO(1999)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分型和分級，星形細(xì)胞瘤78例，節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤4例，惡性室管膜瘤6例，室管膜母細(xì)胞瘤2例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤4例，促纖維增生形細(xì)胞瘤2例;Ⅰ級膠質(zhì)瘤19例，Ⅱ級膠質(zhì)瘤28例，Ⅲ級膠質(zhì)瘤29例，Ⅳ級膠質(zhì)瘤20例;膠質(zhì)瘤≤4 cm者34例，>4 cm者62例. 另外取正常腦組織22例作為對照. 全部標(biāo)本經(jīng)40 g/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，復(fù)查HE切片，在HE切片上找到腫瘤細(xì)胞伏擊的區(qū)域并對照蠟塊的相應(yīng)的位置作標(biāo)記，確定取材位點(diǎn). 用制備組織芯片的空心蠟?zāi)Ｄ＞咧谱鲀?nèi)徑為2 mm的空心蠟?zāi)? 用內(nèi)徑為2 mm的組織芯片取樣器在蠟塊的標(biāo)記位點(diǎn)取出組織蠟芯，并將其輕放入空心蠟?zāi)５目字校凑找欢ǖ捻樞虬卜潘械哪[瘤組織蠟芯，制作成組織微陣列并對組織芯片蠟塊進(jìn)行4 μm連續(xù)切片，裱褙于APES防脫片膠預(yù)處理的載玻片上，待行免疫組織化學(xué)染色.

　　1.2 方法 免疫組織化學(xué)染色操作流程參照Elivision說明書，一抗PCNA抗體稀釋濃度為1∶80，PTEN抗體稀釋濃度為1∶20，二抗酶標(biāo)羊抗鼠/兔聚合物，DAB顯色，蘇木素復(fù)染， 以PBS替代一抗作為陰性對照, 用已知PCNA和PTEN陽性的前列腺癌切片作陽性對照. PCNA陽性結(jié)果為腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核染成棕黃色或者棕褐色. 參考文獻(xiàn)[1]的標(biāo)準(zhǔn)，以圖像分析儀雙盲法閱片, 每個(gè)標(biāo)本觀察200倍光鏡下視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞根據(jù)PCNA陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞百分率,將其分為4級:Ⅰ級:1%～25%;Ⅱ級:26%～50%; Ⅲ級:51 %～75%;Ⅳ級:>75%. 其中Ⅰ～Ⅱ級為弱陽性(+),Ⅲ～Ⅳ級為強(qiáng)陽性(). PTEN以腫瘤細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性. 參考文獻(xiàn)[2]的標(biāo)準(zhǔn)，按染色強(qiáng)度評分: 0分為無色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色. 再按陽性細(xì)胞所占的百分比評分:0分為陰性,1 分為陽性細(xì)胞≤10%, 2分為11%～50%, 3分為51%～75%, 4分為>75%; 染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積: 9～12分為強(qiáng)陽性(),5～8分為弱陽性(+),0～4 分為陰性(-).

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用χ2檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析，分析PTEN蛋白和PCNA抗原的表達(dá)與各臨床，病理指標(biāo)的相互關(guān)系.

　　2 結(jié)果

　　2.1 腦膠質(zhì)瘤組織PCNA和PTEN的表達(dá) 腦膠質(zhì)瘤組織PCNA的表達(dá)陽性率為67.7%(65/96)，正常腦組織為9.1%(2/20)，差異顯著(P<0.01);腦膠質(zhì)瘤組織PTEN的表達(dá)(E,F)陽性率為52.1%(50/96)，正常腦組織為95.5%(21/22)，差異顯著(P<0.01). PCNA的表達(dá)與組織學(xué)分型和分級有關(guān)

　　2.2 PTEN表達(dá)與組織分化程度的關(guān)系 PTEN在高分化腦膠質(zhì)瘤(組織學(xué)分級Ⅰ～Ⅱ級)組織中表達(dá)陽性率為68.1%(32/47), 高于在低分化腦膠質(zhì)瘤(組織學(xué)分級Ⅲ～Ⅳ級)組織中表達(dá)陽性率36.7%(18/49)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01). 在腦膠質(zhì)瘤患者中隨著組織學(xué)分級的升高，PTEN的表達(dá)量呈下降趨勢. PTEN在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)陽性率57.7%(45/78)，與PTEN在非星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)陽性率27.8%(5/18)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

　　腦膠質(zhì)瘤組織PCNA和PTEN的陽性表達(dá)

　　膠質(zhì)瘤組織學(xué)分級和分型與PCNA和PTEN表達(dá)

　　I～ II級與III～I(xiàn)V級比較：χ2=14.8412，P=0.0001;χ2=9.4477，P=0.0021; 星形細(xì)胞瘤與非星形細(xì)胞瘤比較：χ2=0.2065，P=0.6496; χ2=5.2441，P=0.0220.

　　3 討論

　　大多數(shù)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展都由多種腫瘤相關(guān)基因改變引起,了解更多腫瘤發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ), 找到用于腫瘤診斷、評價(jià)預(yù)后和治療的腫瘤標(biāo)記物, 對于研究腫瘤是十分重要的. Kononen等[3]首先提出組織芯片的概念, 已成為研究基因與基因產(chǎn)物的重要工具. PCNA是Kononen等[4]首先發(fā)現(xiàn)并命名，在細(xì)胞增殖過程中起重要作用，是評價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo). 我們發(fā)現(xiàn)，96例膠質(zhì)瘤中有65例PCNA陽性表達(dá)(67.7%，65/96)，明顯高于正常腦組織(9.1%，2/22，P<0.05). 導(dǎo)致PCNA的高表達(dá)率主要是由于PCNA的半衰期約20 h,剛離開周期的細(xì)胞中仍能測到殘留的未降解的PCNA蛋白[5]. 而且PCNA在DNA修復(fù)和(或)在非周期細(xì)胞的生長因子的作用下可能有選擇性的PCNA表達(dá)[6]. 我們發(fā)現(xiàn)，47例Ⅰ～Ⅱ級腦膠質(zhì)瘤中PCNA陽性率為48.9%(23/47)，49例Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤中PCNA陽性率高達(dá)85.7%(42/49),Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤中陽性率顯著高于Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤(P<0.05);并且PCNA與腦膠質(zhì)瘤的組織學(xué)分級呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.494, P<0.05). 因此我們認(rèn)為，PCNA的過度表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂,影響膠質(zhì)瘤的增殖和分化, 參與了膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展，它的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性行為相關(guān). PCNA陽性的腫瘤細(xì)胞分布不均勻，不同區(qū)域或不同惡性程度的腫瘤陽性細(xì)胞數(shù)差異很大. 一方面說明膠質(zhì)瘤具有異質(zhì)性，同一腫瘤內(nèi)不同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞的生物特性不盡相同.

　　PTEN是一個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，與蛋白酪氨酸磷酸酶同源，該基因定位于染色體q23.3，在多個(gè)進(jìn)展期腫瘤有突變[6]. Hamada等[7]研究發(fā)現(xiàn),PTEN基因突變主要出現(xiàn)在組織惡性程度高，組織學(xué)更具侵襲性的膠質(zhì)瘤中，而在組織惡性程度低的膠質(zhì)瘤中極少存在,從而推測PTEN基因突變與由低度惡性向高度惡性過渡有關(guān). Dickerson等[8]發(fā)現(xiàn), PTEN突變、缺失在原發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤中更為常見, PTEN基因在別的膠質(zhì)瘤中表達(dá)率低于低級別的膠質(zhì)瘤,從而證明PTEN失表達(dá)在膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展中起重要作用. 我們發(fā)現(xiàn), PTEN的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的組織學(xué)分型有關(guān)，在星型細(xì)胞瘤中的表達(dá)陽性率與其在非星型細(xì)胞瘤中的表達(dá)陽性率比較(P<0.05). PTEN在腦膠質(zhì)瘤Ⅲ，Ⅳ級組織內(nèi)的表達(dá)顯著低于Ⅰ，Ⅱ級，隨著組織學(xué)分級的升高，PTEN的表達(dá)呈下降趨勢,說明PTEN的表達(dá)隨膠質(zhì)瘤組織惡性程度的變化而改變, 即膠質(zhì)瘤組織學(xué)分級越高其表達(dá)水平越低,證明該基因的失活在膠質(zhì)瘤的惡性階段為明顯,PTEN的低表達(dá)可能促進(jìn)了腫瘤組織由高分化向低分化演進(jìn)的過程，提示該基因與膠質(zhì)瘤的演化及侵襲進(jìn)程關(guān)系密切，PTEN表達(dá)下調(diào)的腦膠質(zhì)瘤更具有惡性表型和惡性行為. 本研究結(jié)果顯示，組織學(xué)分級越高,年齡越大,PTEN蛋白的表達(dá)越低,提示PTEN基因的失活參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生，可能與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展及患者預(yù)后有關(guān).