全身照射引起間充質(zhì)干/祖細(xì)胞池縮小及成骨潛能改變

作者：馬杰,陳斌,王宏蘭,李靜,史明霞,李炳宗　　作者單位：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織工程研究中心，北京 100005

　　【摘要】為了研究輻射對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSC)數(shù)量及成骨分化潛能的影響，探討B(tài)MMSC在輻射損傷中的反應(yīng)及其與照射后造血和骨骼系統(tǒng)長(zhǎng)期損傷的關(guān)系，用全身照射(total body irradiation, TBI)小鼠模型觀察TBI前后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠骨髓纖維母細(xì)胞集落形成單位(colonyforming unitfibroblast, CFUF)的改變及BMMSC細(xì)胞周期分布情況;用Von Kossa染色法測(cè)定鈣鹽沉積,實(shí)時(shí)定量RTPCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因及成骨轉(zhuǎn)錄共刺激因子TAZ (transc[x]riptional coactivator with PDZbinding motif)的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：TBI后骨髓CFUF數(shù)量明顯減少;TBI后3天較多的BMMSC進(jìn)入細(xì)胞周期并且其成骨潛能明顯增強(qiáng)，隨后細(xì)胞周期分布恢復(fù)正常，但成骨潛能明顯降低，同時(shí)伴有TAZ表達(dá)改變。結(jié)論：TBI能導(dǎo)致小鼠骨髓間充質(zhì)干/祖細(xì)胞池的顯著縮小并改變BMMSC的成骨分化潛能，TAZ表達(dá)的變化可能在其成骨潛能的改變中發(fā)揮一定作用。

　　【關(guān)鍵詞】 全身照射;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;成骨潛能;TAZ

　　Abstract To investigate the effect of irradiation on the quantity and osteogenesis potential of BMMSCs and to explore the response of them in the irradiation stress and its contribution to longterm effects of radiationinduced bone and hematologic injury, a total body irradiation (TBI) murine model was adopted. The number of CFUF and cell cycle profile of BMMSCs were analyzed at different time points before and after TBI. Osteogenic differentiation was evaluated by Von Kossa staining, ex[x]pressions of osteogenesisrelated genes and transc[x]riptional coactivator with PDZbinding motif (TAZ) were detected by realtime RTPCR. The results showed that the number of CFUF decreased greatly at day 28 after TBI. At day 3 after TBI， more cells entered cell cycle and the osteogenesis potential was greatly enhanced followed by recovery of cell cycle distribution and signifiacant defect in osteoblast differentiation respectively, meanwhile the ex[x]pression of TAZ was changed. It is concluded that TBI results in the reduction of bone marrow mesenchymal stem/progenitor cell pool and alters the osteogenesis potential of BMMSCs, which is related to the change of TAZ ex[x]pression.

　　Key words TBI;bone marrow mesenchymal stem cell; osteogenesis potential; TAZ

　　放射治療在目前仍是腫瘤治療中的一個(gè)重要手段，但是這種治療方法并非是腫瘤特異性的，正常組織尤其是造血和骨骼系統(tǒng)極易受到損害。隨著接受放射治療的腫瘤患者生存狀況的改善，對(duì)放射治療導(dǎo)致的一些遠(yuǎn)期機(jī)制的探討顯得尤為重要。以往多認(rèn)為造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSC)的凋亡[1,2]、自我更新能力及HSC池的縮小[3,4]和成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的改變[5]分別是照射后造血和骨骼系統(tǒng)損傷的機(jī)制。然而造血功能的維持不僅與造血細(xì)胞本身有關(guān)，還與造血微環(huán)境息息相關(guān)，而骨容量的調(diào)控尤其是在病理?xiàng)l件下的調(diào)控皆依賴于足夠的成骨干/祖細(xì)胞的存在[6]。 骨髓中與HSC共存的BMMSC不僅能生成骨髓微環(huán)境中的大多數(shù)細(xì)胞，并且是成骨細(xì)胞的來(lái)源。此外，BMMSC因其多向分化潛能、分泌多種細(xì)胞因子及強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，在損傷等病理生理情況下參與組織修復(fù)。因此，本研究利用全身照射的小鼠模型研究輻射對(duì)BMMSC的影響，并從BMMSC水平初步探討放射治療后一些遠(yuǎn)期損傷的可能機(jī)制。

　　材料和方法

　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及輻射損傷模型制備

　　5周齡雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組和全身照射組，后者經(jīng)137Cs射線進(jìn)行一次性全身照射4.0 Gy，吸收劑量率為2.4 Gy/min。每批動(dòng)物分別在照射后的0、1、3、7、14和28天取股骨和脛骨，所得到的BMMSCs分別命名為D0，D1，D3，D7，D14和D28。

　　主要試劑和儀器

　　FicollPaque分離液為Pharmacia公司產(chǎn)品，胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品，100 μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、0.125%胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco公司，DF12、MCDB、地塞米松、β磷酸甘油鈉、抗壞血酸均購(gòu)自Sigma公司，F(xiàn)lk1 抗體購(gòu)自Santa Cruz 公司，CD34、CD45、CD31、GlyA、vWF、CD11a、CD11b 抗體購(gòu)自晶美生物工程有限公司，TRIzoL為Invitrogen公司產(chǎn)品，5×Buffer、 RTdNTP、 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、OligdT均購(gòu)自TaKaRa公司;realtime試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，流式細(xì)胞儀為Becton Dickinson公司產(chǎn)品，realtime PCR儀(ABI PRISM7500)為Applied Biosystems公司產(chǎn)品)。

　　小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的制備和BMMSC的分離及培養(yǎng)

　　無(wú)菌狀態(tài)下取雄性C57 BL/6小鼠的股骨和脛骨，用4號(hào)針頭反復(fù)沖洗，將沖出的骨髓，制成單細(xì)胞懸液。用FicollPaque(1.077 g/ml)分離出單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells, BMMNC)并計(jì)數(shù)，應(yīng)用MACS CD45，GlyA和CD34磁珠去除其中的造血細(xì)胞,以107/ml的細(xì)胞密度接種在25 cm2 的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。培養(yǎng)液成分為40% MCDB、55% DF12、4%胎牛血清、100 U/ml青霉素和1 000 U/ml鏈霉素,置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24小時(shí)后去掉懸浮細(xì)胞,細(xì)胞融合達(dá)70%時(shí)，用0.125 %胰酶消化并以1∶2比例傳代。這些細(xì)胞的免疫表型傳代30次以上始終保持CD34、CD45、CD31、vWF、GlyA、CD11a、CD11b陰性, Flk1陽(yáng)性(資料未顯示)，因而我們稱之為Flk1+MSC。

　　CFUF計(jì)數(shù)

　　以2×105/cm2 的密度將BMMNC接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中。在37℃、 5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每3天換液1次，在第9天去掉培養(yǎng)液，用DHank 液洗2遍，甲醇固定后，結(jié)晶紫染色。在100倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，大于50個(gè)纖維母細(xì)胞樣的細(xì)胞集落才被認(rèn)為是CFUF。

　　細(xì)胞周期測(cè)定

　　于細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期消化細(xì)胞并測(cè)DNA的含量。細(xì)胞首先用70%的冰乙醇4℃固定過(guò)夜，用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2遍，然后用40 μg/ml的RNase A 37℃孵育20分鐘，加入3 μg/ml 碘化丙錠，室溫孵育5分鐘，用流式細(xì)胞儀測(cè)定。

　　成骨的定向誘導(dǎo)分化和鑒定

　　以2×104/cm2的密度將細(xì)胞加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1.0×10-8 mol/L地塞米松、2.0×10-4 mol/L抗壞血酸、7.0×10-3 mol/L β磷酸甘油的IMDM)，每3天半量換液1次，每天觀察1次。用Von Kossa 染色檢測(cè)鈣質(zhì)沉積，即中性甲醛固定1小時(shí)后，去離子水沖洗，加入2%硝酸銀溶液，37℃避光反應(yīng)10分鐘，去離子水沖洗后爆光15分鐘，光學(xué)顯微鏡下觀察鈣化基質(zhì)沉淀。

　　RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄

　　取體外擴(kuò)增的小鼠BMMSC及擴(kuò)增后成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞按照TRIzoL說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。每瓶貼壁細(xì)胞加1 ml TRIzoL液裂解，加0.2 ml三氯甲烷，冰浴后12 000×g離心10分鐘。上層水相移出后加異丙醇500 μl 12 000×g離心10分鐘。75%乙醇洗RNA 1次。將RNA配成30 μl逆轉(zhuǎn)錄體系(5×Buffer 6 μl, RTdNTP 2 μl, 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，RNase抑制劑1 μl，OligdT 3 μl，DEPC水17 μl)。

　　RTPCR

　　Realtime RTPCR前，cDNA產(chǎn)物在20 μl體系中行PCR以檢測(cè)成骨指標(biāo)，如Cbfa1(corebinding factors)/Runx2、Ⅰ型膠原(type 1 collagen，Col1)、骨鈣蛋白(osteocalcin, OC)、成骨蛋白(osteopontin, OPN)和TAZ的表達(dá)。反應(yīng)條件為：95℃ 5分鐘，94℃ 40秒，58℃-62℃ 40秒，72℃ 40秒，循環(huán)32次，后72℃延伸7分鐘。引物及其相應(yīng)退火溫度如表1。

　　熒光實(shí)時(shí)定量RTPCR(real time RTPCR)

　　Realtime RTPCR測(cè)定正常及照射后1、3、7、14和28天小鼠BMMSC TAZ的表達(dá)及上述的BMMSC體外成骨誘導(dǎo)1周或3周后成骨相關(guān)基因Cbfa1、Col1、OC和OPN的表達(dá)。以βactin為管家基因，應(yīng)用嵌入熒光染料SYBR Green I進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μl，含2×Premix 10 μl, 上游和下游引物各1 μl，模板cDNA 1 μl，DEPC水7 μl。擴(kuò)增條件為：95℃ 15秒，94℃ 15秒，58℃-62℃ 30秒，72℃ 40秒，40個(gè)循環(huán)，引物及退火溫度如表1。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　應(yīng)用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有顯著意義，P<0.01為差異有極顯著意義。

　　結(jié) 果

　　TBI后骨髓間充質(zhì)干/祖細(xì)胞池縮小

　　預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，小鼠接受不同劑量(2、 4、 6.5 和 8 Gy)的TBI后，BMMNC和CFUF的數(shù)量改變呈劑量和時(shí)間依賴性。我們選擇4 Gy作為TBI的劑量進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。如圖1所示，4 Gy TBI后BMMNC迅速降低，在TBI后第3天達(dá)低點(diǎn)，此后逐漸恢復(fù)，在TBI后28天基本恢復(fù)至正常水平。而CFUF/106 BMMNC在第3天高，然后逐漸下降，至第28天仍未見(jiàn)恢復(fù)的趨勢(shì)。分析每只小鼠后肢中所含CFUF，我們發(fā)現(xiàn)，雖然CFUF的數(shù)量在TBI后第3天稍有回升，但其后表現(xiàn)為長(zhǎng)期的降低，4周內(nèi)未見(jiàn)恢復(fù)。

　　TBI對(duì)BMMSC細(xì)胞周期的影響

　　用流式細(xì)胞儀檢測(cè)正常及TBI后3、7和28天BMMSC細(xì)胞周期分布，結(jié)果如圖2和表2所示。正常情況下(86.1±2.64)% BMMSC處于G0/G1期，在TBI后第3天較多細(xì)胞進(jìn)入S期(P=0.002)，但在TBI后28天BMMSC細(xì)胞周期的分布又恢復(fù)至正常。

　　TBI后BMMSC的體外成骨潛能的變化

　　如圖3所示，TBI前后不同時(shí)間點(diǎn)BMMSC在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)3周后，進(jìn)行Von Kossa染色發(fā)現(xiàn)其成骨潛能明顯改變。TBI后3天成骨潛能明顯增強(qiáng)，而TBI 7天后則明顯下降，分別表現(xiàn)為黑色礦化物沉積的明顯增多和減少。4周內(nèi)成骨潛能未見(jiàn)明顯恢復(fù)。

　　TBI后BMMSC成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)

　　TBI后一些成骨相關(guān)基因的表達(dá)呈時(shí)間依賴性，并與體外誘導(dǎo)時(shí)限相關(guān)。如圖4 A和B所示，體外成骨誘導(dǎo)1周，核心結(jié)合因子1 (corebinding factor 1，Cbfa1)、Ⅰ型膠原(type 1 collagen，Col1)和骨鈣蛋白(osteocalcin， OC)在TBI后3天BMMSC中表達(dá)高，在TBI后28天表達(dá)低。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的表達(dá)同樣在TBI后3天高，但其余時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與正常均無(wú)差異。而在成骨體系中培養(yǎng)3周，TBI后3天BMMSC Cbfa1的表達(dá)仍然高，不同的是Col1和OC的表達(dá)在TBI后28天達(dá)高峰，TBI后3天低。TBI后不同時(shí)間點(diǎn)OPN的表達(dá)與正常無(wú)差異。

　　TBI后BMMSC TAZ的表達(dá)

　　Realtime RTPCR 方法檢測(cè) TBI 前后不同時(shí)間點(diǎn)BMMSC TAZ的表達(dá)，TAZ在TBI后3天表達(dá)高，但TBI后7天明顯降低，4周

　　內(nèi)其表達(dá)未見(jiàn)恢復(fù)。

　　討 論

　　近年來(lái)，在充分認(rèn)識(shí)MSC的生物學(xué)特性后，有關(guān)MSC，尤其是BMMSC在損傷、疾病及衰老等病理生理情況下所發(fā)揮的作用和其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用都取得了較多進(jìn)展。重要的是，一些研究顯示BMMSC在某些疾病的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用[7,8]，在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)TBI后骨髓間充質(zhì)干/祖細(xì)胞池明顯縮小，體外成骨潛能改變顯著。

　　CFUF是一種對(duì)間充質(zhì)干/祖細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行量化的檢測(cè)方法[9]。通過(guò)對(duì)TBI前后CFUF的監(jiān)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)TBI對(duì)BMMSC的影響首先表現(xiàn)為間充質(zhì)干/祖細(xì)胞池的縮小。雖然通過(guò)凋亡的早期檢測(cè)方法Annexin V分析，我們沒(méi)有觀察到BMMSC的明顯的凋亡(結(jié)果未顯示)，但這一結(jié)果并不能排除TBI后體內(nèi)BMMSC發(fā)生凋亡。干細(xì)胞的自我更新能力在維持干細(xì)胞池的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，因而TBI后骨髓間充質(zhì)干/祖細(xì)胞池的縮小是否源于BMMSC自我更新能力的改變還需進(jìn)一步研究。

　　除了BMMSC數(shù)量的改變，通過(guò)Von Kossa染色和成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的分析我們發(fā)現(xiàn)，TBI能顯著改變BMMSC體外的成骨潛能。只有完全成熟的成骨細(xì)胞才能產(chǎn)生基質(zhì)并礦化。Cbfa1是成骨分化的重要調(diào)控因子，能調(diào)控分化的成骨細(xì)胞骨沉積的速率[10-12]，TBI后Cbfa1表達(dá)的變化與Von Kossa染色結(jié)果是一致的。Col1是成骨分化過(guò)程的早期標(biāo)志之一，它在成骨分化早期被誘導(dǎo)表達(dá)，在鈣質(zhì)沉積將結(jié)束時(shí)表達(dá)降低[13]，而OC是分化成熟的成骨細(xì)胞的標(biāo)志，僅表達(dá)于完全分化的成骨細(xì)胞，而在成骨分化的終末階段即分化至骨細(xì)胞和骨襯細(xì)胞(bone lining cells)時(shí)則不表達(dá)[14]。體外成骨誘導(dǎo)1周時(shí)， TBI后3天BMMSC的上述成骨相關(guān)基因表達(dá)明顯增高，提示TBI后早期成骨細(xì)胞分化過(guò)程加速。誘導(dǎo)3周即成骨細(xì)胞分化以成熟基質(zhì)礦化為特征時(shí)，TBI后28天BMMSC不僅缺乏應(yīng)有的鈣質(zhì)沉積(Von Kossa結(jié)果所示)，其成骨分化相關(guān)基因Col1和OC高表達(dá)，提示分化的成骨細(xì)胞仍然處于一個(gè)早期的不成熟的階段。而此時(shí)TBI后3天BMMSC的Col1和OC量明顯降低，這可能反映了成骨細(xì)胞已分化至終末階段即分化為骨細(xì)胞。OPN是骨基質(zhì)形成時(shí)的另一個(gè)標(biāo)志，成骨分化過(guò)程中它的表達(dá)呈雙峰，即首先表達(dá)于活躍的細(xì)胞增殖期，然后降低，在細(xì)胞開(kāi)始礦化時(shí)表達(dá)再次增高[15]。這一表達(dá)的雙時(shí)相性可能是TBI后OPN表達(dá)變化不顯著的原因。TAZ是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)WW模體結(jié)合于Cbfa1/Runx2的PPPY結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生共激活作用[16]，進(jìn)而調(diào)節(jié)MSC向成骨分化而抑制成脂分化[17]。我們的研究結(jié)果顯示，TBI后BMMSC TAZ的變化趨勢(shì)和Cbfa1的一致，這種變化在向成骨誘導(dǎo)前就已經(jīng)存在。以上這些結(jié)果說(shuō)明，TBI干擾了成骨細(xì)胞的分化過(guò)程，損傷的早期BMMSC成骨分化潛能明顯增強(qiáng)，而終成骨細(xì)胞生成受阻，TAZ的表達(dá)變化可能是導(dǎo)致這一變化的原因之一。

　　正常情況下體內(nèi)的干細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，在機(jī)體受到應(yīng)激或損傷時(shí)它們將重新進(jìn)入細(xì)胞周期促進(jìn)組織的再生與修復(fù)[18]。我們觀察到的TBI后早期更多的BMMSC進(jìn)入細(xì)胞周期及成骨潛能的增強(qiáng)提示，在放射損傷的早期BMMSC通過(guò)增殖能力和成骨能力的增強(qiáng)來(lái)盡力維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但是BMMSC的這種代償功能是有限的。成骨細(xì)胞不僅在骨骼系統(tǒng)的維持中發(fā)揮重要作用，它還是骨髓造血龕位(niche)的重要組成成分[19]，因而TBI所導(dǎo)致的骨髓間充質(zhì)干/祖細(xì)胞池的縮小及其成骨分化潛能的降低使成骨細(xì)胞的分化明顯受阻，這可能是放射損傷后造血和骨骼系統(tǒng)遠(yuǎn)期功能障礙的干細(xì)胞水平的機(jī)制。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　1Domen J, Gandy KL, Weissman IL. Systemic overex[x]pression of BCL2 in the hematopoietic system protects transgenic mice from the consequences of lethal irradiation. Blood, 1998;91: 2272-2282

　　2Meng A, Wang Y, Brown SA, et al. Ionizing radiation and busulfan inhibit murine bone marrow cell hematopoietic function via apoptosisdependent and independent mechanisms. Exp Hematol, 2003; 31: 1348-1356

　　3Lohrmann H, Schreml W. Longterm hematopoietic damage after cytotoxic drug therapy for solid tumors. In: Testa NG, Gale RP. eds. Hematopoiesislongterm effects of chemotherapy and radiation. New York: Marcel Dekker Inc. 1988: 325-337

　　4Testa NG, Hendry JH, Molineux G. Longterm bone marrow damage in experimental systems and in patients after radiation or chemotherapy. Anticancer Res,1985;5:101-110

　　5Hopewell JW. Radiationtherapy effects on bone density. Med Pediatr Oncol, 2003; 41:208-211

　　6Blair HC, Carrington JL. Bone cell precursors and the pathophysiology of bone loss. Ann NY Acad Sci, 2006;1068:244-249

　　7Fang B, Zheng C, Liao L, et al. Identification of human chronic myelogenous leukemia progenitor cells with hemangioblastic characteristics. Blood, 2005;105:2733-2740

　　8李炳宗，李靜，史明霞等.多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓Flk1+間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2006;26：586-592

　　9Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science, 1997;276(5309):71-74

　　10Komori T, Yagi H, Nomura S, et al. Targeted disruption of Cbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts. Cell, 1997; 89:755-764

　　11Otto F, Thornell AP, Crompton T, et al. Cbfa1, a candidate gene for cleidocranial dysplasia syndrome, is essential for osteoblast differentiation and bone development. Cell,1997; 89: 765-771

　　12Ducy P. Cbfa1: a molecular switch in osteoblast biology. Dev Dyn, 2000;219: 461-471

　　13Beck GR Jr, Zerler B, Moran E. Gene array analysis of osteoblast differentiation. Cell Growth Differ, 2001;12: 61-83

　　14Castro CH, Shin CS, Stains JP, et al. Targeted ex[x]pression of a dominantnegative Ncadherin in vivo delays peak bone mass and increases adipogenesis.J Cell Sci, 2004;117(Pt 13):2853-2864

　　15de oliverra PT, Zalzal SF, Irie K, et al. Early ex[x]pression of bone matrix proteins in osteogenic cell cultures. J Histochem Cytochem, 2003; 51:633-641

　　16Cui CB, Cooper LF, Yang X, et al.Transc[x]riptional coactivation of bonespecific transc[x]ription factor Cbfa1 by TAZ. Mol Cell Biol, 2003, 23:1004-1013

　　17Hong JH, Hwang ES, McManus MT, et al. TAZ, a transc[x]riptional modulator of mesenchymal stem cell differentiation.Science, 2005; 309(5737):1074-1078

　　18Rubin H. The disparity between human cell senescence in vitro and lifelong replication in vivo. Nat. Biotechnol, 2002; 20: 675-681

　　19Zhang J, Niu C, Ye L, et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.Nature, 2003; 425(6960):836-841