微囊化胰島細胞移植治療糖尿病的實驗研究

作者：方立峰

作者單位：(鄭州市人民醫(yī)院消化科，河南 鄭州 450004)

【摘要】  目的 觀察微囊化大鼠胰島細胞移植治療糖尿病小鼠的療效。方法 將糖尿病小鼠隨機分為三組：生理鹽水注入組、未囊化胰島細胞移植組和微囊化胰島細胞移植組。將生理鹽水、純化大鼠胰島細胞和囊化大鼠胰島細胞分別移植于三組糖尿病小鼠腹腔。結(jié)果 分離的胰島細胞對刺激反應(yīng)良好，微囊化和未囊化胰島細胞移植后均可糾正糖尿病小鼠的高血糖狀態(tài)，但微囊化胰島細胞移植組可維持正常血糖水平更長時間。結(jié)論 微囊化胰島細胞移植治療糖尿病小鼠具有良好的效果，微囊具有較好的免疫隔離作用。

【關(guān)鍵詞】  微囊；胰島細胞移植；糖尿病

    Experimental treatment of diabetes with microencapsulated rat islet cells transplantation

    FANG Lifeng （Department of Gastroenterology，the 1st People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou Henan 450004, China)

    Abstract: ob[x]jective   To observe the effect of treating diabetic mice with microcapsulated rat islet cell transplantation. Methods   Diabetic mice were randomly divided into 3 groups:control group， nomicroencapsulated islet cells transplantation group and microencapsulated islet cells transplantation group. Normal saline, pared rat islet cells and microcapsulated islet cells were respectively transplantated into abdominal cavity of three groups of diabetic mice. Results  The isolated islet cells had a good reaction for glucose stimulation. Both the microcapsulated islet cell transplantation and nonmicrocapsulated islet cell transplantation could be decreased the high blood glucose level，and the former one kept longer. Conclusion   It is believed that microcapsulated islet cell transplantation exerts good effect on diabetic mice and the microcapsules have good immunoisolating function.

    Keywords: microcapsulation; islet cell transplantation; diabetes

    胰島移植不僅可以糾正糖尿病的高血糖狀態(tài)，而且可以防止或延遲糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。異種胰島遠比人源胰島來源豐富，但是嚴重的免疫排斥反應(yīng)限制了異種移植。應(yīng)用生物材料制作的海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微膠囊，其半通透性的囊膜將細胞包裹，只允許小分子的營養(yǎng)物和細胞分泌物自由通過，限制大分子的免疫成分和細胞進入，從而達到延長移植物存活的免疫隔離作用［12］。本實驗將微囊化、未囊化的大鼠胰島細胞分別異種移植到糖尿病模型小鼠體，以觀察兩種移植控制糖尿病小鼠血糖的效果。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    采用SD大鼠(180～220 g)、昆明小鼠(20～25 g)，雌雄不拘，由鄭州大學實驗動物中心提供。多聚賴氨酸、海藻酸鈉、Histopaque1077、膠原酶、鏈脲霉素均為Sigma公司產(chǎn)品。RP MI1640為Gibco公司產(chǎn)品。胰島素測定放免試劑盒為天津德普公司生產(chǎn)。京都2型血糖儀。

    1.2  動物模型制作

    小鼠腹腔注射鏈脲霉素(160 mg/kg)制作糖尿病小鼠模型，血糖連續(xù)2次高于16.5 mmol/L者定為糖尿病鼠。將糖尿病小鼠隨機分為如下3組(每組5只)進行觀察：①生理鹽水注入組；②未囊化胰島細胞移植組；③微囊化胰島細胞移植組。

    1.3  胰島分離與純化

    SD大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(500 mg/kg)麻醉，經(jīng)膽總管插管注入膠原酶溶液(1 mg/mL)至胰腺完全充盈，迅速摘取胰腺置37 ℃水浴消化20～25 min，加入4 ℃ MHBSS緩沖液終止消化，震蕩數(shù)次。180× g離心2 min，過300～400目濾網(wǎng)，將400目濾網(wǎng)反沖收集網(wǎng)上物，180× g離心2 min，連續(xù)2次，吸凈上清液。向所得胰腺組織每管加入10 mL Histopaque1077分離液，震蕩使胰腺組織與分離液混勻，再緩慢加入等體積的RP MI1640培養(yǎng)液，4 ℃ 900× g離心20 min，收集界面處的胰島細胞，用MHBSS緩沖液洗滌3次。

    1.4  胰島刺激試驗

    倒置顯微鏡下挑選100～300 μm 的胰島細胞置24孔板中，30個/孔。分別加入含2.75 mmol/L，16.5 mmol/L葡萄糖及16.5 mmol/L葡萄糖加0.5 mmol/L茶堿的RP MI1640培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24 h后取上清液，用胰島素放免試劑盒測定胰島素分泌量。

    1.5  統(tǒng)計學處理

    所有數(shù)椐均以±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行F檢驗法統(tǒng)計學分析。P＜0.05為統(tǒng)計學差異顯著。

    2  結(jié)果

    2.1  葡萄糖刺激胰島素分泌實驗

    靜止葡萄糖刺激試驗顯示所收獲的胰島細胞對葡萄糖刺激反應(yīng)良好。在2.75 mmol/L和16.5 mmol /L葡萄糖及16.5 mmol/Ｌ葡萄糖加0.5 mmol/L茶堿作用下，平均每孔24個胰島的胰島素分泌量見表1，表明所收獲的胰島細胞具有調(diào)節(jié)性的胰島素分泌功能。將分離的大鼠胰島進行APA微囊化，所得微囊呈球形，表面光滑，直徑在200～400 μm，每個囊內(nèi)包裹有1～2個胰島。將微囊胰島進行胰島素刺激釋放實驗，結(jié)果表明在上述的低糖、高糖和高糖加茶堿條件下其胰島素分泌每24個胰島分泌量見表1。表明微囊化大鼠胰島仍維持較好的功能，且微囊及未微囊胰島的胰島素分泌無差異（見表1）。表1  微囊及未微囊大鼠胰島的胰島素分泌比較*：與未微囊胰島組比較，P＞0.05

    2.2  胰島細胞移植對糖尿病小鼠血糖水平的影響

    胰島細胞移植前糖尿病小鼠血糖濃度為20.3～26.7 mmol/L。將所收獲的胰島細胞植入腹腔后，未移植組小鼠在觀察期內(nèi)呈持續(xù)高血糖狀態(tài)，生理鹽水注入組小鼠高血糖無明顯改變，未囊化胰島細胞移植組可使小鼠血糖降低持續(xù)3 d，而微囊化胰島細胞移植組小鼠血糖降低可持續(xù)30 d以上(長達100 d)，見表2。表2  糖尿病小鼠異體移植大鼠胰島細胞前后的血糖變

    3  討論

    由于胰島移植可提供接近生理性的胰島素分泌，對控制糖尿病慢性并發(fā)癥具有積極意義。異種胰島與人源胰島相比具有豐富的來源，但是異種胰島移植存在嚴重的免疫排斥反應(yīng)。1980年，有作者發(fā)明了免疫隔離APA微膠囊，用其包裹異種胰島后進行移植，可明顯延長異種胰島的存活和功能維持時間。近該實驗室以APA微囊化豬胰島異種移植治療自發(fā)性糖尿病猴的研究表明，通過1～3次移植，可使7只糖尿病猴在停用胰島素的情況下，使禁食、血糖水平維持正常達120～804 d［24］。

    胰島細胞移植可提供接近生理性的胰島素分泌，對控制糖尿病慢性并發(fā)癥具有積極的意義，是治療糖尿病較理想的方法。我們在引進微囊制作技術(shù)的基礎(chǔ)上，又改進了APA微囊制作技術(shù)，可根據(jù)胰島細胞團的大小制出相應(yīng)體積的微囊以減少機械性死腔，更有利于囊內(nèi)胰島細胞存活。通過采用一步法純化胰島細胞以縮短純化時間，可減少梯度純化對胰島細胞的損傷［46］。本實驗表明：未囊化胰島細胞移植組糖尿病小鼠移植的大鼠胰島細胞在3 d內(nèi)可發(fā)揮降低血糖作用，3 d后因異體免疫排斥反應(yīng)而喪失功能，使小鼠血糖上升至移植前水平。而微囊化胰島細胞移植組小鼠血糖降低可持續(xù)30 d以上，長一只達100 d，明顯長于未囊化移植組［79］。移植30 d后，從小鼠腹腔回收的微囊大部分表面光滑、完整，證明APA微囊化胰島細胞移植可在異種體內(nèi)長期存活，APA微囊具有良好的生物相容性和免疫隔離作用，初步表明了APA微囊作為細胞系移植工具的可行性。

【參考文獻】
  ［1］ 郭俊召，陳 兵，別 平.胰島細胞移植治療糖尿病現(xiàn)狀與進展［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2006，28（6）：610-612.

［2］ Tang TH, Li CL, Li X, et al.Immune tolerance in pancreatic islet xenotransplantation［J］.World J Gastroenterol, 2004,10(10):1457-1461.

［3］ 晏 輝，張勝蘭，姜兆順，等.人胎胰島細胞移植對Ⅰ型糖尿病的遠期治療效果［J］.前衛(wèi)醫(yī)藥雜志,2000,17(2):76-78.

［4］ 徐 剛，袁敏生，Weir GC.胰島細胞移植的現(xiàn)狀［J］.中國糖尿病雜志，2001，9(3):188-190.

［5］ 邱 立，李富榮，楊雪菲.周漢新烏司他丁在大鼠胰島分離中的抗凋亡作用［J］.廣東醫(yī)學，2007，28（1）：28-30.

［6］ 袁 超，于立新，杜傳福，等.免疫抑制劑對糖尿病小鼠胰島細胞移植長期存活效果的研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2006，8 （8）：1-4.

［7］ 羅 蕓，薛毅瓏，李雁凌，等.微囊化大鼠胰島細胞移植治療糖尿小鼠的實驗研究［J］.標記免疫分析與臨床，2006，13（1）：38-39.

［8］ 姚燕丹，章樂虹，胡以則.豬胰島細胞移植治療糖尿病臨床應(yīng)用研究［J］.廣州醫(yī)學院學報，2000，28(1):83-86.

［9］ 羅 蕓，薛毅瓏，李崇輝.應(yīng)用淋巴細胞分離液純化大鼠胰島的實驗研究［J］.軍醫(yī)進修學院學報，2004，25(4):299-300.