牛黃酸和VC對(duì)染砷小鼠腦神經(jīng)損傷保護(hù)作用

作者：樸豐源，楊光，李秋娟，葉建新，孫鮮策，馬寧

作者單位：1.大連醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生學(xué)教研室，大連 116044； 2.日本國立三重大學(xué)醫(yī)學(xué)部

【摘要】  目的 觀察牛黃酸和維生素C(VC)對(duì)砷暴露導(dǎo)致的腦組織核酸損傷的保護(hù)作用，為砷毒性腦損傷的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。方法 昆明種小鼠40只，隨機(jī)分為4組：4?mg/L三氧化二砷染毒組、150?mg/kg牛黃酸和45?mg/kg VC拮抗組以及生理鹽水對(duì)照組。每周2次，連續(xù)染毒60d，取小鼠腦組織固定，用免疫組化方法觀察腦組織神經(jīng)細(xì)胞8硝基鳥嘌呤(8-NO2-G)的表達(dá)。結(jié)果 染砷組小鼠腦組織出現(xiàn)異常病理學(xué)改變，腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的胞漿中8-NO2-G呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)。而牛黃酸和VC拮抗組小鼠腦組織出現(xiàn)輕度的病理學(xué)變化8-NO2-G表達(dá)。結(jié)論 牛黃酸和VC對(duì)砷暴露小鼠腦組織RNA損傷具有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】  三氧化二砷；腦；8硝基鳥嘌呤；免疫組化；拮抗劑

　　Protection of taurine and vitamin C on damage of brain nerve in mice exposed to arsenic

　　PIAO Fengyuan，YANG Guang,LI Qiujuan,et al.

　　Department of Hygiene,Dalian Medical University(Dalian 116027,China)

    Abstract： ob[x]jective  To observe prerention of taurine and vitamin C from RNA damage of cerebral neurons in mice exposed to arsenic.Methods  Forty mice were divided into 4 groups,one control and one experimental group receiving As2O3,two antagonistic groups receiving taurine with As2O3 or vitamin C with As2O3,were administered for 60 days.Immunohistochemistry method was used to investigate 8nitroguanine ex[x]pression in cerebral neurons of mice.Results  The pathological changes and stronger ex[x]pression of 8nitroguanine were observed in the brain cortex of mice exposed to arsenic.In the two antagonistic groups,the light pathological changes and exprexssion of 8nitroguanine were shown in brain tissue of mice.Conclusion  Taurine and vitamin C may have the preventive effect on RNA damage of cerebral neurons in mice exposed to arsenic.

    Key words： As2O3；brain;8nitroguanine;immunohistochemistry;antagonistic agent

　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，砷可以通過血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，慢性砷暴露的豚鼠和大鼠腦中砷濃度與暴露呈顯著正相關(guān)〔1〕。Chaudhuri等研究發(fā)現(xiàn)，即使砷在飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍內(nèi)，也能影響體內(nèi)氧化還原平衡，增高腦脂質(zhì)過氧化水平，降低谷胱甘肽(GSH)濃度和抗氧化酶活性，使腦組織受到自由基損害，引起神經(jīng)細(xì)胞異常凋亡〔2〕。但是，砷誘發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷機(jī)制尚不十分清楚。目前認(rèn)為，砷暴露使機(jī)體產(chǎn)生過量的活性氧族(ROS)和活性氮族(RNS)，導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞的核酸等生物大分子損傷是砷中毒的重要機(jī)制之一〔3〕。本研究以小鼠為研究對(duì)象，以8硝基鳥嘌呤(8Nitroguanine)作為砷毒性作用導(dǎo)致的核酸損傷標(biāo)志物，以維生素C(VC)和牛磺酸作為拮抗劑，通過免疫組化方法，觀察拮抗劑對(duì)砷暴露導(dǎo)致的腦組織核酸損傷的保護(hù)作用，為砷毒性腦損傷的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料

　　(1)As2O3(美國Sigma公司)；VC(沈陽新興試劑廠)；牛黃酸(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)；抗8Nitroguanine(8NO2G)單克隆抗體(德國Bremen公司)；Ultra SensitiveTMSP超敏試劑盒、二氨基連本氨(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；其他試劑均為分析純；(2)主要儀器：石蠟切片機(jī)(YD1508B，浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠)；BX51萬用光學(xué)顯微鏡(日本Olypus公司)；DC290數(shù)碼相機(jī)(日本Kodak公司)；分析處理系統(tǒng)(Imagepro plus 4.5)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  動(dòng)物處理

　　成熟健康昆明種小鼠40只，雌雄各半(大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。按體重隨機(jī)分為4組(每組10只)：4?mg/L的三氧化二砷(As2O3)染毒組；45mg/kg VC和150?mg/kg?；撬岬?個(gè)拮抗劑干預(yù)組；生理鹽水對(duì)照組。前3組通過自然飲用含As2O3自來水方染毒，拮抗劑是以灌胃方式投給，每周2次。每天測體重和水消耗量。連續(xù)染毒60?d，處死小鼠后立即取腦組織固定。

　　1.2.2  腦組織形態(tài)學(xué)觀察

　　腦組織經(jīng)福爾馬林固定后，常規(guī)石蠟包埋，5?μm連續(xù)切片，在65℃溫箱中烤片60?min;蘇木素伊紅(HE)染色，光鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

　　1.2.3  腦組織免疫組織化學(xué)觀察

　　按照S-P免疫組化染色法〔4〕，在腦組織切片上滴1：300稀釋的鼠抗人8NO2G單克隆抗體，在4℃條件下孵育過夜，然后按Ultra SensitiveTMS-P超敏試劑盒的步驟進(jìn)行(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，自來水沖洗返藍(lán)。常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。閱片時(shí)，先觀察整張切片，再隨機(jī)選擇不同區(qū)域的5個(gè)高倍視野，并拍照，并應(yīng)用圖像分析軟件對(duì)8NO2G表達(dá)的平均吸光度值進(jìn)行定量的分析。

　　1.3  統(tǒng)計(jì)分析

　　用Scheff′s test 方法進(jìn)行組間均數(shù)比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

　　2  結(jié)  果

　　2.1  腦組織病理學(xué)觀察(圖1)  光鏡觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞未見異常病理變化，染砷組小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，胞漿和胞核內(nèi)有空泡變性，核碎裂、核質(zhì)溶解等明顯的病理學(xué)改變。而在拮抗組小鼠的腦神經(jīng)細(xì)胞中上述病理變化不明顯。

　　2.2  腦組織核酸損傷的免疫組織化學(xué)觀察(圖2，表1) 表1  各組小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞抗8NO2G免疫染色平均光密度值(略) 注：a 含有4?mg/L As2O3的自來水自然飲用，150?mg/kg牛磺酸和45?mg/kg VC組每周灌胃2次，持續(xù)60?d。與對(duì)照組比較，b P<0.05,c P<0.01；與?；撬岣深A(yù)組比較，d P<0.05,與VC干預(yù)組比較，e P<0.05。

　　采用標(biāo)記的鏈菌素親生物蛋白(LSAB)免疫組化方法檢測小鼠腦組織8NO2G的表達(dá)水平。對(duì)照組小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞中幾乎無8NO2G的表達(dá)，染砷組小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞中靠近細(xì)胞膜的胞漿被染成棕褐色，呈現(xiàn)明顯的抗8NO2G陽性反應(yīng)，而牛黃酸和VC拮抗組小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞中只有輕度的8NO2G的表達(dá)。各組小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的抗8NO2G免疫染色平均光密度值，實(shí)驗(yàn)組小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的抗8NO2G免疫染色平均光度密值明顯大于對(duì)照組和2個(gè)拮抗組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

　　3  討  論

    8NO2G是由活性氮族，過氧亞硝酸陰離子或二氧化氮攻擊核酸的產(chǎn)物，可進(jìn)一步導(dǎo)致突變、癌變的發(fā)生。Ma等曾報(bào)道胃炎病人的胃粘膜上皮中有8NO2G表達(dá)，并認(rèn)為8NO2G不僅是炎癥的標(biāo)志物，還是一種判斷是否癌變傾向的指示物〔5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性砷暴露的小鼠腦皮質(zhì)中有8NO2G的高表達(dá)，說明砷暴露可以導(dǎo)致腦的核酸損傷。而且，8NO2G的表達(dá)主要集中在靠近細(xì)胞膜的胞漿中。 由于8NO2G在DNA的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行迅速的脫嘌呤反應(yīng)，它在RNA中要比在DNA更為穩(wěn)定〔6〕，說明砷暴露小鼠腦組織8NO2G的高表達(dá)可能主要與砷致神經(jīng)細(xì)胞RNA損傷有關(guān)。作者曾經(jīng)報(bào)道過砷引起小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的氧化性DNA損傷〔7〕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，砷可能通過ROS引起DNA的氧化損傷，而通過RNS則主要引起RNA損傷。同時(shí)也提示，腦皮質(zhì)神經(jīng)元可能是砷的神經(jīng)毒性作用的主要靶細(xì)胞。

    牛黃酸是機(jī)體的內(nèi)源性抗損傷物質(zhì)，可清除幾乎所有的自由基和活性氧。水溶性VC是重要的細(xì)胞外液抗氧化物，且在細(xì)胞內(nèi)液也有重要的抗氧化性能，能有效消除氧自由基〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，投給牛磺酸和VC的小鼠腦組織的病理變化相對(duì)較輕，而且腦皮質(zhì)中8NO2G的表達(dá)也比砷暴露組少。結(jié)果提示，?；撬岷蚔C對(duì)砷誘導(dǎo)的RNS致腦組織神經(jīng)細(xì)胞RNA損傷也具有一定的保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能與?；撬岷蚔C通過減少氧自由基，阻止NO與氧自由基等反應(yīng)而生成過多的過氧亞硝基陰離子有關(guān)。

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