脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與肥胖、2型糖尿病的相關(guān)性

作者單位：西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科；遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061

【摘要】  目的 探討中國(guó)人群內(nèi)脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11391G/A、-11377C/G基因多態(tài)性以及突變與肥胖、2型糖尿病(T2DM)的相關(guān)性。方法 選取研究對(duì)象共305名，利用聚合酶鏈反應(yīng)限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCRRFLP)方法鑒定-11391G/A、-11377C/G基因型。結(jié)果 ①在所選群體中未發(fā)現(xiàn)-11391G/A突變； ②以基因型分組：-11377 GG基因型體重指數(shù)(BMI)值明顯高于CC，CG基因型，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GG基因型舒張壓、收縮壓明顯高于CC，CG基因型，且與CG基因型差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CC基因型高密度脂蛋白(HDL)高且與CG基因型差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 在西安人群內(nèi)未發(fā)現(xiàn)-11391G/A突變；-11377C/G基因多態(tài)性與BMI的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；未發(fā)現(xiàn)11377C/G基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】  脂聯(lián)素；糖尿病；肥胖；基因多態(tài)性

基金項(xiàng)目：陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2005K14G6)

　　Association of SNPs in the proximal promoter region of　the APM1 gene with obesity and type 2 diabetes

　　Ye Feng, He Lan, Li Jianning, Dong Chunping, Yu Jie

　　(Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710061; Department of Genetics and Molecular Biology,Medical School of Xian Jiaotong University; Xian 710061, China)
　　ABSTRACT: ob[x]jective  To study the correlation of SNPs -11391G/A, -11377C/G with obesity and type 2 diabetes. Methods  The PCRRFLP technique was adopted to test the gene frequencies of adiponectin in 305 people. Results  ① The -11391G/A mutation was not found in our research population; ② Subjects with the GG genotype at position -11377 had a significantly higher BMI than those with the GC, CC genotype (P<0.05); more over, GG genotype at position -11377 had an increased risk of high systolic blood pressure and diastolic blood pressure compared with GC genotype (P<0.05). HDL had a significant difference between CC and CG genotype (P<0.05). Conclusion  The11391G/A mutation has not been found in our research population; SNP -11377C/G may contribute to the genetic risk for BMI but not T2DM.

　　KEY WORDS: adiponectin; diabetes mellitus; obesity; gene polymorphism

　　脂聯(lián)素是20世紀(jì)90年代中期發(fā)現(xiàn)的由成熟脂肪細(xì)胞特異分泌的具有抗炎、增加胰島素敏感性及心血管保護(hù)作用的脂肪細(xì)胞因子。人類的脂聯(lián)素由244個(gè)氨基酸組成,主要由3個(gè)部分組成:氨基末端的信號(hào)序列、膠原蛋白樣結(jié)構(gòu)域、羧基末端的球形結(jié)構(gòu)域[1]。自全基因組掃描發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素基因定位于染色體3ｑ27，而該區(qū)域存在Ｔ2ＤＭ和代謝綜合征的易感位點(diǎn)以來(lái)，脂聯(lián)素基因突變和(或)單核苷酸多肽性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)愈來(lái)愈成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。因此，本研究旨在探討中國(guó)人群內(nèi)脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11391G/A、-11377C/G基因多態(tài)性或突變與肥胖、2型糖尿病的相關(guān)性。

　　1  材料與方法

　　1.1  研究對(duì)象  來(lái)源于2004年至2006年我院門(mén)診、體檢中心及住院患者，共305名，分為糖尿病組和正常組。 ①T2DM組：共204例，個(gè)體間無(wú)親緣關(guān)系，其中男120例，女84例。年齡均≥40歲，平均(54.65±11.81)歲，糖尿病的診斷依據(jù)1997年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)。 ②正常對(duì)照組：共101名，其中男73例，女28例，年齡均≥40歲，平均(57.93±12.13)歲，均為經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)排除糖尿病的我院體檢的正常人，無(wú)糖尿病家族史。

　　1.2  方法

　　1.2.1  專人測(cè)血壓、身高、體重、腰圍及臀圍、計(jì)算體重指數(shù)(BMI)  血甘油三酯(TG)及血總膽固醇(TC)用酶法測(cè)定。FPG采用指端末梢血測(cè)定(羅氏公司)；空腹血胰島素(FINS)采用放免法。

　　1.2.2  脂聯(lián)素基因-11391G/A或-11377C/G變異的檢測(cè)  ①DNA的提?。喝】崭轨o脈血(EDTA抗凝)0.2mL，用全血DNA提取試劑盒(北京天為時(shí)代科技有限公司產(chǎn)品)抽提基因組DNA； ②PCR擴(kuò)增：從Genbank中查取人脂聯(lián)素基因序列，由北京奧科公司設(shè)計(jì)合成引物[2]：上游引物(24bp): 5′ TGG TGG ACT TGA CTT TAC TGG TAG 3′,下游引物(21bp)：5′ TAG AAG CAG CCT GGA GAA CTG 3′。PCR反應(yīng)體系(25μL)：模板DNA 1.5μL，上下游引物各1.3μL，2×Master Mix(北京天為時(shí)代)12.5μL，ddH2O 8.4μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min后進(jìn)入主循環(huán)，變性95℃ 1min，退火61℃ 30s；延伸72℃ 1min，共36個(gè)循環(huán)，完成后72℃維持10min，擴(kuò)增在PCR儀(美國(guó)Perkin Elmers Cetus公司產(chǎn)品)上完成。擴(kuò)增產(chǎn)物用20g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以100bp為標(biāo)志物長(zhǎng)度間距(天為時(shí)代Marker Ⅰ)，產(chǎn)物片段大小為335bp； ③酶切：37℃酶切水解4-16h。酶切產(chǎn)物以25g/L的瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠/紫外線檢測(cè)。-11377C/G用Hha1(Fermentas公司產(chǎn)品)限制性內(nèi)切酶酶切，-11391G/A分別用HapⅡ (Takara公司產(chǎn)品)和AIuI(Fermentas公司產(chǎn)品)限制性內(nèi)切酶酶切。

　　1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  運(yùn)用HardyWeinber平衡檢驗(yàn)確認(rèn)研究樣本的群體代表性。基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各組基因型頻率及等位基因頻率。正態(tài)分布計(jì)量資料用±s表示，組間基因型頻率及等位基因頻率的比較用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料組間比較用 ANOVA檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05，統(tǒng)計(jì)分析用SPSS10.0軟件處理。

　　2  結(jié)果

　　2.1  -11391G/A、-11377C/G基因型和等位基因頻率的分布  -11391G/A無(wú)論是用HapⅡ 酶還是AIuⅠ酶所得結(jié)果一致，在所測(cè)群體中均未發(fā)現(xiàn)突變。-11377C/G以糖尿病和正常人分組，兩組的基因型和等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。按照亞太地區(qū)肥胖界定標(biāo)準(zhǔn)將全部受試對(duì)象分為肥胖(BMI≥25)和非肥胖組(BMI＜25)，比較脂聯(lián)素基因頻率的分布，BMI≥25組GG基因型頻率明顯高于BMI＜25組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。我們還分析了以糖尿病和正常人分組，BMI分層后各組間-11377C/G基因頻率的差別，結(jié)果無(wú)論糖尿病組還是正常組，BMI≥25相對(duì)于BMI＜25的GG基因型均有明顯增高的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　表1  -11377C/G基因型和等位基因頻率在糖尿病組和對(duì)照組中的分布（略）

　　Table 1  Frequency distribution of -11377C/G in diabetes and control groups

　　T2DM: type 2 diabetes mellitus; NC: normal control

　　表2  -11377C/G基因型和等位基因頻率在肥胖組和非肥胖組中的分布（略）

　　Table 2  Frequency distribution of -11377C/G in obesity and control groups

　　BMI: body mass index

　　2.2  -11377C/G基因型表型的分析  以基因型分組，-11377GG基因型BMI值明顯高于CC，CG基因型，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 GG基因型舒張壓、收縮壓明顯高于CC，CG基因型，且與CG基因型差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CC基因型HDL高且與CG基因型差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。三組間甘油三酯有增高的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

　　表3  -11377C/G不同基因型的臨床基本特征（略）

　　Table 3  Basic clinical characteristics of different -11377C/G genotypes

　　DBP: diastolic blood pressure; SBP: systolic blood pressure; TC: total cholesterol; TG: triglyceride; HDLC:high density lipoproteincholesterol; LDLC: low density lipoproteincholesterol; *P<0.05, vs. GG group; #P<0.05, vs. CC group

　　3  討論
   
　　脂聯(lián)素是通過(guò)增加脂肪酸氧化和抑制肝糖輸出來(lái)改善胰島素敏感性的。血中脂聯(lián)素水平的降低伴隨著B(niǎo)MI、炎性因子、心血管疾病發(fā)病率的增加以及胰島素敏感性的降低，是聯(lián)系胰島素抵抗和肥胖的核心因子，被認(rèn)為是代謝綜合征的標(biāo)志物[3]。人脂聯(lián)素基因位于染色體3q27，長(zhǎng)約17kb，包含三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子。有研究表明脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11391G/A、-11377C/G基因變異可影響血中脂聯(lián)素水平，與肥胖、2型糖尿病相關(guān)。
   
　　我們的研究主要是探討中國(guó)人群內(nèi)脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子區(qū)-11391G/A、-11377C/G基因變異與肥胖、2型糖尿病的相關(guān)性。在我們所研究的正常組人群中-11377C/G的等位基因頻率分別為C=71.3，G=28.7，與國(guó)外報(bào)道的正常人平均基因頻率接近[C=75.4，G=24.6(rs266729，NCBI)]，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在所檢人群中未發(fā)現(xiàn)-11391G/A突變。這說(shuō)明在中國(guó)陜西漢族人群范圍內(nèi)無(wú)該位點(diǎn)的突變或該位點(diǎn)的突變罕見(jiàn)。這與國(guó)外對(duì)該位點(diǎn)報(bào)道的結(jié)論不一致，出現(xiàn)這種差別的原因可能與種族差異或樣本量大小有關(guān)。
   
　　我們的研究結(jié)果認(rèn)為G等位基因可能是肥胖的易感基因之一。這與Gu等[2]的研究結(jié)論相反。出現(xiàn)這種偏差的原因可能是，①研究的人群不同：他們研究的是瑞典高加索糖尿病人群，而且對(duì)年齡沒(méi)有明顯的限制，而我們的研究人群是中國(guó)陜西漢族人，且年齡范圍均控制在40歲以上；②樣本量大小不一樣：Gu等的樣本量為103人，而我們的是305人。同時(shí)，在我們的研究中還發(fā)現(xiàn)GG基因型舒張壓、收縮壓、甘油三酯均有明顯增高趨勢(shì)，由于肥胖、舒張壓、收縮壓、甘油三酯均是冠心病的高危因素。因此，SNP11377C/G與冠心病的相關(guān)性還值得進(jìn)一步探討。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)此方面的報(bào)道。
   
　　另外，在我們的研究中并未發(fā)現(xiàn)11377C/G基因多態(tài)性與2型糖尿病有相關(guān)性。這與Gibson，Populaire等[45]的研究結(jié)果一致，與Vasseur等[6]的結(jié)論相悖。他們不僅發(fā)現(xiàn)11377C/G基因多態(tài)性與2型糖尿病相關(guān)，而且還發(fā)現(xiàn)SNP11391G/A或SNP11377C/G的基因類型決定了糖尿病患者的脂聯(lián)素水平。這種結(jié)果的不一致性除了上述的種族差異，樣本量大小不同，樣本納入標(biāo)準(zhǔn)不一樣等因素外，可能還存在以下幾種因素：①2型糖尿病是一個(gè)復(fù)雜性的疾病，基因與環(huán)境的相互作用在其發(fā)病機(jī)制中占有主導(dǎo)地位，因此有基因易感傾向的個(gè)體不一定必然發(fā)展為糖尿病，這還與個(gè)體所處的環(huán)境有關(guān)[7]；②2型糖尿病是高度異質(zhì)性疾病，在不同的人群中可能存在不同的起主導(dǎo)作用的基因；③有研究表明，納入的糖尿病人群有無(wú)家族史也會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的終結(jié)果。這是因?yàn)橛屑易迨窌r(shí)，遺傳易感性可能涉及到更多的基因，使得單個(gè)基因的作用顯得相對(duì)較弱，而且連鎖不平衡的存在也會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的終結(jié)果。
   
　　綜上所述，本研究結(jié)果表明脂聯(lián)素SNP11377C/G位點(diǎn)與西安地區(qū)漢族人群中2型糖尿病無(wú)明顯相關(guān)性，但與BMI有顯著相關(guān)性，而11391G/A在所研究人群中未發(fā)現(xiàn)突變。這僅僅是脂聯(lián)素基因的2個(gè)SNP或突變的結(jié)果。脂聯(lián)素基因是否為中國(guó)人2型糖尿病或肥胖的易感基因還必須對(duì)該基因的全部多態(tài)性(包括啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)的多態(tài)性)進(jìn)行全基因分析才能作出準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。

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