【摘要】 本研究探討人巨細(xì)胞病毒(hCMV)體外感染是否可引起早幼粒細(xì)胞的增殖、分化抑制、誘導(dǎo)其凋亡,并探討其作用機(jī)制。 采用hCMV AD169 株體外感染早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL60,用PCR 檢測(cè)hCMV DNA,用形態(tài)學(xué)觀察、DNA 片段化檢測(cè)及Annexin Ⅴ/PI 染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)等方法分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明: hCMV AD169 株在體外能明顯抑制早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL60的生長(zhǎng),抑制程度與病毒感染滴度呈劑量依賴關(guān)系;PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)病毒感染組HL60 細(xì)胞中有hCMV IEA 的表達(dá);形態(tài)學(xué)觀察和DNA 片段化檢測(cè)證實(shí)了細(xì)胞凋亡的存在;流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示HL60 細(xì)胞凋亡率隨培養(yǎng)液中病毒濃度的加大和感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增高,二者呈依賴關(guān)系。結(jié)論: hCMV AD169株在體外可直接感染HL60 細(xì)胞;hCMV AD169 株在體外感染HL60 細(xì)胞后,可抑制HL60 細(xì)胞的分化和增殖;hCMV AD169 株體外感染HL60 細(xì)胞后可誘導(dǎo)其凋亡,且凋亡率與病毒劑量及作用時(shí)間呈依賴性關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】 人巨細(xì)胞病毒 早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 病毒感染
Human Cytomegalovirus Induces Apoptosis of Human Promyelocytic Leukemic Cells via Direct Infection In Vitro
LI XiaoFeng, WANG QingWen, HE ZhengXian, CHEN Hong, CHEN MeiLian, CHEN JianLiang, YANG Mo1
Department of Pediatrics, The Third Affiliated Hospital of Sun YatSen University, Guangzhou 510630, China; 1Department of Pediatrics, Chinese University of Hongkong, China
Abstract The study was purposed to investigate the proliferation and the suppression effect of human cytomegalovirus (hCMV) on human promyelocyte cell line HL60, and to study whether hCMV can induce apoptosis of HL60 via direct infection in vitro and its mechanism. Promyelocyte cell line HL60 and hCMV AD169 strain were cocultured. PCR was used to detect the direct infection of HL60 cells by hCMV IEA ex[x]pression. The apoptosis cells were analyzed by morphologic observation, DNA ladder formation, flow cytometry with Annexin Ⅴ/PI stain. The results indicated that hCMV AD169 suppressed the differentiation and proliferation of HL60 cells in vitro significantly (P<0.05). The suppression was dosedependent. hCMV DNA was successfully detected in HL60 cells of viral infection groups by PCR. The apoptotic cells were confirmed by morphologic observation and DNA ladder formation. The results of flow cytometry showed that the percentage of apoptotic cells increased along with the increase of hCMV titer and the time after infection. It is concluded that the promyelocyte can be infected directly by hCMV AD169 strain. hCMV AD169 strain inhibited the differentiation and proliferation of promyelocyte. The apoptosis of HL60 cells can be induced by hCMV infection. With the increase of viral infectious titer and the time after infection,the percentage of apoptotic cells also increase and produce in dosedependent and time dependent manner. Induced apoptosis may be one of the mechanisms of granulocytopenia induced by hCMV infection.
Key words human cytomegalovirus; promyelocytic leukemic cell; apoptosis; virus infection
J Exp Hematol 2007; 15(1):63-66
人巨細(xì)胞病毒(hCMV)是一種在人群中廣泛存在的病毒,兒童是其原發(fā)感染的主要的人群,受感染者的造血、血液系統(tǒng)是主要受累部位之一[1]。對(duì)hCMV感染的研究,特別是對(duì)于器官移植后hCMV感染的研究,一直是國(guó)際上醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。如今,hCMV感染已被認(rèn)為是骨髓移植和白血病化療失敗的主要原因之一[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)hCMV和造血細(xì)胞作用的研究多集中于CFUGM、CFUE、CFUMix及CFUMK方面,實(shí)驗(yàn)證實(shí)hCMV對(duì)各系造血祖細(xì)胞的分化和增殖均有抑制作用[2,3]。hCMV是否能誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡的問(wèn)題尚無(wú)定論,國(guó)內(nèi)尚未有類似研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采 用hCMV體外感染早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系HL60,研究hCMV對(duì)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的影響,并初步探討其作用機(jī)制。
病毒
hCMV AD169株取自華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科病毒實(shí)驗(yàn)室,效價(jià)為2×107 pfu/ml,應(yīng)用前部分病毒原液用單倍RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋10倍、100倍、1000倍,依次獲取效價(jià)為 10-1 hCMV原液組,10-2 hCMV原液組,10-3 hCMV原液組的病毒液。
細(xì)胞株
早幼粒細(xì)胞白血病HL60細(xì)胞株由香港中文大學(xué)兒科系實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng),用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng),每周換液3次,傳代1次。取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
主要試劑
RPMI 1640培養(yǎng)液粉劑是美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品(批號(hào)1165062)。hCMV檢測(cè)試劑盒購(gòu)于華美生物工程公司。DNA抽提試劑盒(K201型)購(gòu)于上海申能博彩生物科技有限公司。Annexin V/PI雙標(biāo)試劑盒購(gòu)于Becton Dickinson Biosciences公司。
感染與分組
病毒感染采用持續(xù)性感染方式,即將hCMV直接加入培養(yǎng)體系中混合培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共分4組,即對(duì)照組(含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液,不加病毒)、10-1hCMV組(10-1組)、10-2hCMV組(10-2組)、10-3hCMV組(10-3組)。
hCMV的PCR檢測(cè)
分別于3、5、7天收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,用PBS洗1-2次,進(jìn)行hCMV DNA抽提,按抽提試劑盒步驟操作,之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用含1 μg/ml EB的2%的瓊脂糖凝膠電泳后鑒定hCMV DNA。
hCMV感染HL60細(xì)胞存活率監(jiān)測(cè)
分別于培養(yǎng)后3、5、7天收集各實(shí)驗(yàn)組部分細(xì)胞,取一滴于玻片上,臺(tái)盼藍(lán)染色后在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)存活率。
hCMV AD169株感染HL60細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
形態(tài)學(xué)觀察 分別在感染之后3、5、7天收集細(xì)胞,Giemsa染色后,在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)并攝影。
DNA斷裂檢測(cè) 分別在感染后3、5、7天收集細(xì)胞,抽提DNA。抽提到的DNA在含1 μg/ml EB的2% 的瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像分析系統(tǒng)在紫外燈下觀察DNA梯樣條帶,并攝影。
Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè) 分別在感染后3、5、7天收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,每次至少收集106個(gè)細(xì)胞,依Annexin V/PI雙標(biāo)試劑盒操作步驟處理細(xì)胞,用Annexin V及PI雙染后,即刻用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞,流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488 nm,用一波長(zhǎng)為515 nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光,另一波長(zhǎng)大于560 nm的濾器檢測(cè)PI,記錄凋亡率。
PI染色流式細(xì)胞儀分析 分別在感染后3、5、7天收集并處理各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,每次至少收集106個(gè)細(xì)胞,PI染色后,即刻用流式細(xì)胞儀檢測(cè),低于G1期DNA含量的亞二倍體細(xì)胞群為凋亡細(xì)胞,記錄凋亡率。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所有資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)記錄,各組間采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較,各實(shí)驗(yàn)組在不同的時(shí)間段進(jìn)行比較。
結(jié) 果
PCR擴(kuò)增各實(shí)驗(yàn)組中hCMV DNA
收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,抽提DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在2%的瓊脂糖凝膠中電泳后,紫外燈下觀察, 各實(shí)驗(yàn)組均可見一條特異性擴(kuò)增條帶,約599 bp,而對(duì)照組未見陽(yáng)性條帶,提示病毒直接感染細(xì)胞,細(xì)胞中存在hCMV DNA(圖1)。
Figure 1. ex[x]pression of hCMV IEA in HL60 cells infected with hCMV. M: marker. Lane 1,2,3: 10-1,10-2,10-3 groups. C:control group.
各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間的細(xì)胞存活率
在感染后3、5、7天,收集各組的部分細(xì)胞,進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,監(jiān)測(cè)細(xì)胞存活力。結(jié)果顯示:隨著病毒濃度的加大,感染后時(shí)間的延長(zhǎng),各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率下降,對(duì)照組不受影響(圖2)。
Figure 2. Effect of hCMV AD 169 on the survival rate of HL60 cells at different days.
Giemsa染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
hCMV感染細(xì)胞后,經(jīng)Giemsa染色至感染后第5天,光學(xué)顯微鏡下觀察顯示,實(shí)驗(yàn)組中有些細(xì)胞透亮度減低,細(xì)胞膜皺縮、核碎裂,提示有凋亡改變。各實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)量略有不同,對(duì)照組未見明顯凋亡細(xì)胞(圖3) 。
Figure 3. Effect of hCMV AD 169 on the morphology of HL60 cells with Giemsa stainning. A,B: morphology of infected cells. C: morphology of control cells.
DNA斷裂檢測(cè)
分別于感染后3、5、7天收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,粗提DNA,瓊脂糖凝膠電泳觀察,在感染后第5天、7天,可見典型的DNA梯形條帶,隨著感染劑量的加大, 條帶逐漸明顯(圖4)。
Figure 4. DNA fragmentations in hCMVinfected HL60 cells. M: marker. C: control group. Lane 1 ,2 ,3: 10-1,10-2,10-3 groups.
Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)
分別于感染后3,5,7天收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,經(jīng)處理后進(jìn)行凋亡檢測(cè),記錄凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),各實(shí)驗(yàn)組的凋亡率明顯高于對(duì)照組,且隨著劑量的加大、時(shí)間的延長(zhǎng),凋亡率逐漸增加(表1)。
Table 1. Apoptosis rate of HL60 cells infected with hCMV (Anxiexin V/ PI) (n=10, ±SD)
GroupApoptosis rate(%)3 days5 days7 daysControl1.80±0.372.36±0.733.35±1.0510-3hCMV4.30±1.85*△#10.70±1.57*△#16.40±1.39*△#10-2hCMV14.80±1.72*△#19.70±2.74*△#26.40±1.68*△#10-1hCMV22.10±2.06*△#28.80±3.16*△#35.20±2.71*△#*Comparison between the hCMV infected groups and the control at the same incubation days (P<0.05). △Comparison between experimental groups of different virus doses at the same incubation days (P<0.05). #Comparison between different groups in different incubation days with hCMV infection (P<0.05).
PI染色流式細(xì)胞儀分析
分別于感染后3、5、7天收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,經(jīng)處理后進(jìn)行凋亡檢測(cè),可見位于G1期前的亞二倍體峰,即為凋亡細(xì)胞群,記錄凋亡率。觀察發(fā)現(xiàn),各實(shí)驗(yàn)組的凋亡率明顯高于對(duì)照組,且隨著劑量的加大,時(shí)間的延長(zhǎng),凋亡率逐漸增加(表2)。
討 論
許多實(shí)驗(yàn)已證實(shí),hCMV感染對(duì)造血祖細(xì)胞各系的分化、增殖均有抑制作用,并可誘導(dǎo)其凋亡[2,3]。hCMV感染細(xì)胞過(guò)程中首先附著于細(xì)胞表面,在合適的離子和PH條件下,借其包膜蛋白(gB和gH)與細(xì)胞表面受體(低結(jié)合力的肝素受體和高結(jié)合力的蛋白受體)結(jié)合后,通過(guò)受體介導(dǎo)的機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。也可通過(guò)其他途徑如直接穿過(guò)胞漿膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),病毒DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)增殖,復(fù)制其核酸和蛋白質(zhì),產(chǎn)生子代,同時(shí)造成組織病變[5]。通過(guò)檢測(cè)宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒核酸和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可反映病毒對(duì)宿主細(xì)胞的直接感染,目前實(shí)驗(yàn)中通常使用PCR檢測(cè)細(xì)胞的hCMV DNA 和用RTPCR檢測(cè)hCMV自我復(fù)制的即刻-早期(immediateearly, IE)mRNA的兩種方法,以判斷病毒是否侵入宿主細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采取具有速度快,特異性強(qiáng),靈敏度高的PCR檢測(cè)感染后HL60細(xì)胞內(nèi)的hCMV DNA。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,按照步驟用hCMVDNA試劑盒抽提感染組和對(duì)照組細(xì)胞的核酸提取物,PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增后,經(jīng)電泳顯示特異性條帶,各感染組特異性條帶均陽(yáng)性,DNA片段長(zhǎng)度約599bp,與理論上設(shè)計(jì)的引物[6] (P1: 5' ATGGAGTCCTCTGCCAAGAGA 3'; P2: 5' CAGCATGTGCTCCTTGAT 3')應(yīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物基本一致,對(duì)照組中未見特異性條帶,表明hCMV AD169株可直接感染HL60細(xì)胞。
我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:病毒感染組HL60細(xì)胞的集落形成均出現(xiàn)不同程度的減少,表明hCMV AD169株實(shí)驗(yàn)株對(duì)HL60細(xì)胞的分化、增殖具有抑制作用。hCMV體外感染的HL60細(xì)胞受到了病毒損傷,其抑制程度與病毒感染濃度及時(shí)間有關(guān),隨著感染時(shí)間延長(zhǎng),病毒濃度加大,細(xì)胞受損程度在增大,呈劑量依賴性,抑制程度與病毒感染濃度呈正相關(guān)。國(guó)外有研究小組曾觀察到hCMV感染對(duì)HL60細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯誘導(dǎo)作用。Moon等[7]報(bào)告hCMV Towne株體外感染HL60細(xì)胞,病毒對(duì)HL-60細(xì)胞的凋亡影響不明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hCMV AD169株可明顯引起HL60細(xì)胞發(fā)生凋亡。這可能與所用的病毒株類以及病毒濃度不同有關(guān)。曾有研究者發(fā)現(xiàn)hCMV毒株的不同導(dǎo)致感染后造血祖細(xì)胞hCMV DNA的表達(dá)不同[8]。
hCMV感染所引起的損傷中,宿主細(xì)胞凋亡較為常見[9]。有研究表明,hCMV感染誘導(dǎo)的造血祖細(xì)胞生長(zhǎng)抑制與細(xì)胞凋亡有關(guān)系。Sindre等[10]用hCMV感染造血祖細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸的表達(dá)減少,特異性的DNA凋亡片段數(shù)目增加,表明hCMV感染同樣可以誘導(dǎo)造血祖細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)用目前比較成熟的定性法和定量法從這三個(gè)方面對(duì)hCMV體外感染HL60細(xì)胞株誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行定性定量的檢測(cè)。結(jié)果表明:hCMV AD169株體外感染能誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡,并隨時(shí)間延長(zhǎng)、病毒濃度的加大而上升。本實(shí)驗(yàn)中hCMV AD169株體外感染誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡,但其凋亡由哪種凋亡蛋白所介導(dǎo),其作用位點(diǎn)在哪里,這些蛋白在其中起什么作用,以及如何阻斷其凋亡,尚需今后的研究工作進(jìn)一步深入探討。
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