IL-15對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞激活的T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用觀察

        手術(shù)、化療和放療是傳統(tǒng)的三大腫瘤治療手段,生物治療以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在腫瘤治療中也占有一席之地,而免疫治療是腫瘤生物治療的核心正常情況下,人體以細(xì)胞免疫為主發(fā)揮著抗腫瘤的作用,而在人體免疫功能作用下仍能發(fā)生腫瘤,其原因可能與腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)視,使機(jī)體不能有效的遞呈腫瘤抗原,以致不能有效活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞(c.Yto_toxicTlymphocyte,CTL)有關(guān)’_DC是機(jī)體功能強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresentingcells,APCs),能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原細(xì)胞因子對(duì)DC的發(fā)育、成熟及免疫功能的發(fā)揮至關(guān)重要許多細(xì)胞因子:IL-2,IL-12、粒一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(grauulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF等作為DC的免疫佐劑,使其誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)得以增強(qiáng).IL-15是一種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子,具有與IL-2類(lèi)似的激活T,B細(xì)胞和NK細(xì)胞的作用.本研究以IL-2為對(duì)照,觀察IL-15對(duì)DC疫苗誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用.
        1材料與方法 
        1.1材料
        IL-15購(gòu)自英國(guó)Peprotech公司.IL-2,IL-4,PE-Cy5-CD8mAb,PE-CD44mAb、PE-CD62LmAh、PE-CD69mAh購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司GM-CSF購(gòu)自美國(guó)R&D公司.脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司ELISPOT試劑盒購(gòu)自瑞士Mahtech公司.C57BL/6小鼠,雌性,6}8周齡購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.Levis肺癌細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保種儲(chǔ)存.
        1.2方法
        1.2.1凍融法制備Levis細(xì)胞抗原取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Levis細(xì)胞,用PBS重懸腫瘤細(xì)胞為2x10'/mL.置于液氮10min后放于37℃水浴中融化,反復(fù)4個(gè)循環(huán)離心取上清即制成含Levis細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞裂解液,置一80℃冰箱凍存?zhèn)溆?
        1.2.2小鼠骨髓DC}BMDCs)的制備及培養(yǎng)無(wú)菌取小鼠股骨和脛骨,用注射器吸取RPMI1640培養(yǎng)基沖洗髓腔,沖洗液離心后棄上清用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,離心后棄上清用含5%FCS,1000L=/mLGM-CSF,SOOU/mLIL-4的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為6x105/mL,加人6孔板中(1.8x10}/孔)培養(yǎng)第8天加人含2x10'/孔腫瘤細(xì)胞裂解液0.1mL,培養(yǎng)4h后加入0.1mL脂多(lihopolvsaccharide,LPS)混勻誘導(dǎo)細(xì)胞成熟.
        1.2.3小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的制備及培養(yǎng)無(wú)菌取小鼠脾臟,注射器芯研磨脾臟濾過(guò)200目鋼網(wǎng),加紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后,用3mLRPMI1640培養(yǎng)基重懸置孵箱備用將尼龍毛柱加人37℃的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基,置于370C孵箱中1h平衡柱子,取出尼龍毛柱加人脾細(xì)胞懸液3mL,370C孵育45min加人20mL預(yù)熱為370C的RPMI1640培養(yǎng)基,以1滴/s的速度洗柱收集濾過(guò)液,得到脾臟T淋巴細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為3x10"/mL.
        1.2.4淋巴細(xì)胞免疫表型測(cè)定采用流式細(xì)胞術(shù)直接免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)淋巴細(xì)胞免疫表型分別收集培養(yǎng)第3,7,14天的各組(IL-2,IL-15)T淋巴細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1x10}hnL,吸取1mL用PBS洗滌后,加人60},LPBS緩沖液及各(PE-Cy5-CD8,PE-CD44,PE-CD62L,PE-CD69)單克隆抗體(mAb)40N.,L,室溫避光孵育40min:每組共設(shè)3個(gè)復(fù)孔,PBS洗滌后行流式細(xì)胞儀檢測(cè).
        1.2.5腫瘤抗原負(fù)載BMDCs誘導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的分析無(wú)菌取健康小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞,制備T淋巴細(xì)胞懸液.調(diào)整T淋巴細(xì)胞濃度為lxlOfi/mL,于6孔板中加人600},L/孔細(xì)胞懸液腫瘤抗原負(fù)載的BMDCs用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1x105/mL,于置有T淋巴細(xì)胞的6孔板中加人300},L/孔細(xì)胞懸液,補(bǔ)足培養(yǎng)基為3mL,每組分別加人10ng/mLIL-        2,125ng/mLIL-15孵箱孵育.7d后收集懸浮細(xì)胞,以含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋作為效應(yīng)細(xì)胞備用.取1mL濃度為3x106/mL的Levis細(xì)胞為靶細(xì)胞,加人100CiNa5'CrOa混勻后置于孵箱孵育2h:Hanks液洗滌3次后用RPMI1640培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為1x106/mL.將各效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按照效靶比(E:T)為160:1,80:1,40:1,20:1加人到%孔U型板中,各設(shè)3個(gè)復(fù)孔同時(shí)設(shè)大釋放組(100p,L靶細(xì)胞、100p,L破膜劑1%triton-X100),小釋放組(100p,L靶細(xì)胞、100p,LRPMI1640培養(yǎng)基)于孵箱孵育4h離心后收集上清100p,L于專(zhuān)用試管中用yi己數(shù)器測(cè)定每管上清液的5.C:釋放量."釋放率=(樣本釋放.pm平均值一小釋放cpm平均值)/(大釋放cpm平均值一小釋放cpm平均值)x.
        1.2.6IFN-,分泌細(xì)胞的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作步驟按照ELISPPOT試劑盒說(shuō)明書(shū)操作調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞濃度為1x106/mL,于96孔培養(yǎng)板中加人100}.L/孔細(xì)胞懸液,各設(shè)3個(gè)復(fù)孔,孵育時(shí)間為24h:將ELISPPOT板置于解剖顯微鏡下(x40),記錄黑紫色斑點(diǎn),拍照_行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
        2結(jié)果
        2.1 IL-15或IL-2對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫表型的影響為研究IL-15或IL-2聯(lián)合DC疫苗對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫表型的影響,本研究對(duì)激活的T淋巴細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)分析了CD8'T細(xì)胞的表型特征,如CD69,CD62L,CD44一采用不同濃度的IL-2(5,10,20或40ng/mL),IL-15(25,125,250或500ng/mL)培養(yǎng)淋巴細(xì)胞,以3,7和14d為時(shí)間梯度檢測(cè)淋巴細(xì)胞免疫表型結(jié)果提示:在第7天時(shí),10ng/mLIL-2或125ng/mLIL-15上調(diào)CD8'T細(xì)胞表達(dá)CD69,CD44分子情況較好,同時(shí)下調(diào)CD62L分子情況亦較好.本實(shí)驗(yàn)選取第7天時(shí),以10ng/mLIL-2和125ng/mLIL-15的條件檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的殺傷活性和分泌IFN-帕勺細(xì)胞數(shù)量(圖1).
        2.2腫瘤抗原負(fù)載BMDCs誘導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的影響為了觀察激活的T淋巴細(xì)胞對(duì)特異性抗原腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,本研究采用"Cr釋放法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的殺傷活性結(jié)果表明,在聯(lián)合DC疫苗的情況下,IL-15或IL-2作為免疫佐劑對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性無(wú)顯著差別,但兩者均顯著高于對(duì)照組(圖2).
        2.3分泌IFN-γ細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè) 為研究IL-15或IL-2對(duì)淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的影 響,本研究取健康小鼠脾臟制備T淋巴細(xì)胞,將DC疫苗與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng),同時(shí)分別加人10ng/mLIL-2或125ng/mLIL-15,7d后收集培養(yǎng)的細(xì)胞行ELISPOT實(shí)驗(yàn),檢測(cè)分泌IFN-帕勺細(xì)胞數(shù)量結(jié)果顯示,經(jīng)DC疫苗刺激后,用含IL-IS的培養(yǎng)基培養(yǎng),每10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞約有50個(gè)IFN-γ分泌細(xì)胞;而用含IL-2培養(yǎng)基培養(yǎng),每10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞約有30個(gè)IFN-γ,分泌細(xì)胞,有顯著性差異(P<0.05).為了排除細(xì)胞因子的非特異性刺激作用,本研究采用無(wú)DC疫苗的IL-15或IL-2為對(duì)照,在無(wú)DC疫苗的刺激下,僅有IL-15或IL-2較難刺激淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ(圖3).
       

        3討論
        DC遞呈抗原的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等其他APCs,其能誘導(dǎo)CTL的抗腫瘤免疫反應(yīng)’,同時(shí)也是細(xì)胞免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者,可以活化初始T細(xì)胞DC與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系腫瘤患者體內(nèi)的DC數(shù)量和功能都有所下降,從而使T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答不能被有效的激活6因此如何改善和提高DC誘發(fā)的免疫反應(yīng),是腫瘤免疫學(xué)研究的熱點(diǎn).
        IL-2常作為DC的免疫佐劑使其誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)得以增強(qiáng),而IL-15在抗腫瘤免疫治療方面的應(yīng)用也得到了研究者的關(guān)注,其具備一些IL-2不具備的優(yōu)勢(shì),如IL-15能激活和擴(kuò)增CD8'T細(xì)胞7-h;不激活調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatoryTcells,Tregs),并解除Tregs對(duì)T細(xì)胞的抑制作用,而Tregs對(duì)免疫的各個(gè)方面都有負(fù)調(diào)節(jié)作用,一’';IL-15不會(huì)引起激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(activation-inducedcelldeath,AICD)而IL-2卻抑制記憶性T細(xì)胞在體內(nèi)的生存,激活并維持Tregs的活性和功能,而且能誘導(dǎo)AICD’ 本研究顯示,初始T淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)DC疫苗刺激后,用IL-15或IL-2均能刺激IFN-,的分泌,并維持和擴(kuò)增抗原特異性CT1雖然IL-15較IL-2能刺激更多的IFN-,分泌細(xì)胞產(chǎn)生,但在特異性殺傷活性方面并未顯示出優(yōu)勢(shì),這可能與初次免疫反應(yīng)較弱,刺激時(shí)間不夠長(zhǎng)有關(guān)IL-15作為一種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子,在二級(jí)結(jié)構(gòu)上與IL-2相似,兩者都屬于4-螺旋的造血因子家族1L-15受體(IL-15PO與IL-2受體(IL-2R)相似,均包含3條鏈,分命名為1L-15Rcx,(3,y,其中日和y亞單位與IL-2的a和,亞單位相同;同時(shí)兩種細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路都包含蛋自酪氨酸激酶(januski-ease,JAK)和信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signalirans-ducerandactivatoroftransc[x]ription,STAT)"止因這兩種細(xì)胞因子的受體具有相同的、亞單位和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,可以解釋本研究觀察到的IL-15與IL-2具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖,維持T淋巴細(xì)胞活性的作川而IL-ISRa與IL-2R.不同,IL-15Ra在機(jī)體的表達(dá)更為廣泛,主要在激活的單核細(xì)胞、DC及基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)_而IL-2Ra主要由激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá),IL-2Ra又名CD25,是Treg細(xì)胞的表型標(biāo)記,部分經(jīng)IL-2激活的淋巴細(xì)胞可能會(huì)轉(zhuǎn)換成Treg細(xì)胞,限制免疫反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)行.
        IL-2促使T-B細(xì)胞或T-T細(xì)胞之間的FastCD95L}和Fas(aD95)相結(jié)合,啟動(dòng)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,是CTL和1VK細(xì)胞殺傷的機(jī)制之一,同時(shí)一也可殺傷活化的T,B細(xì)胞,下調(diào)細(xì)胞免疫和體液免疫雖然IL-2是一個(gè)強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖刺激因子,但是長(zhǎng)期大量的使用反而可能會(huì)通過(guò)以上這些機(jī)制限制免疫反應(yīng)的進(jìn)行而口前未發(fā)現(xiàn)IL-15下調(diào)細(xì)胞免疫和體液免疫.
        鑒于以上分析,在抗腫瘤免疫治療中,本研究認(rèn)為IL-15可能是較IL-2更好的免疫佐劑,進(jìn)一步的體內(nèi)抗腫瘤免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究是今后擬進(jìn)行的工作.
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