丙型肝炎病毒感染者外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化及意義

        丙型肝炎病毒(HCV)感染是當(dāng)今危害人類健康的重要公共衛(wèi)生問題之一。全球約有1. 7億人感染HCV，而我國約占}. 4億上’〕。持續(xù)的HCV'感染會 導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝癌等z-a。大量研究證實，多種宿主因素，例如:年齡、性別、飲酒、種族、合并 Hl3'} , HLV感染等以及宿主免疫狀態(tài)均與HC}'感染疾病進(jìn)展密切相關(guān)。越來越多的證據(jù)顯示，機體免疫狀態(tài)是決定HCV慢性感染后疾病進(jìn)展快慢的關(guān)鍵因素。機體感染HCV后，人體中淋巴細(xì)胞亞群間的平衡被打破，表現(xiàn)為外周血淋巴細(xì)胞亞群百分比、數(shù)或功能改變，這些均在一定程度上反映了機體免疫狀態(tài)的變化‘〕。目前，國內(nèi)外相關(guān)的研究已經(jīng)提出了不同年齡階段的健康人群外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化及參考值范圍，這些淋巴細(xì)胞亞群參考值，為評價免疫相關(guān)性疾病的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)提供了重要的參考依據(jù)s-}}。然而，目前國內(nèi)外還沒有大樣本丙型肝炎人群外周血淋巴細(xì)胞亞群的報道。本文回顧性分析了解放軍三O二醫(yī)院生物治療研究中心2001年6月- 2009年12月期間采用FACSCalibur檢測的未使用干擾素等藥物治療的241例丙型肝炎人群，并以以往報道的117例健康人群外周血淋巴細(xì)胞亞群頻率作為對照s，提出了中國HCV感染人群不同疾病階段的外周血淋巴細(xì)胞亞群分布范圍，并重點分析了上述淋巴細(xì)胞亞群頻率與年齡、性別以及疾病進(jìn)程關(guān)系，從而為臨床判斷HC}'感染后機體的免疫狀態(tài)、診治及療效評估提供參考依據(jù)。
 

        1材料與方法
 

        1. 1研究對象收集2001年6月-2009年12月期間解放軍三O二醫(yī)院生物治療研究中心檢測的 241例HC}} 感染人群(男149例，女92例)以及117例健康體檢人群 (男69例，女48例)外周血淋巴細(xì)胞亞群頻率;其中99% 以上是漢族。所有感染患者均未使用干擾素和利巴韋林藥物治療。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)會2000 年修訂的《病毒性肝炎防治方案》，將HCV感染人群分為慢性肝炎(181例)、代償期肝硬化(60例)。根據(jù)年齡段，將人群分為3一14歲(20例),15一49歲(130例)以及〕 50歲(91例)3個層次。

        1.2流式細(xì)胞檢測方法采用的FAC}Calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。外周血淋巴細(xì)胞亞群使用 BD公司}imulset TM IMK一淋巴細(xì)胞亞群免疫熒光試劑盒。所用單克隆抗體組合為:FITC一抗CD45/PE - 抗CD14 ( A ) , FITC一IgG1/PE一IgG2a ( B ) , FITC一抗 CD3/PE一抗CD19 ( C ) , FITC一抗CD3/PE一抗CD4 ( D ) , FITC一抗CD3/PE一抗CD8(E) ,FITC一抗CD3/ PE一抗CD16十抗CD56 ( F。外周血淋巴細(xì)胞染色方案如下:A,B,C,D,E,F樣品測定管中各加人50瀏新鮮外周靜脈抗凝血標(biāo)本，依次加人上述熒光標(biāo)記抗體各10州，振蕩混勻，室溫避光孵育20 min;加人1 ml 溶血素，振蕩混勻，室溫避光放置10 min ,1200 r/min 離心5 min，棄上清液，加人PBS 1 m1,1200 r/min離心 4 min，棄上清液，加人400閃PBS,混勻后上機檢測，采用SimuISET軟件獲取分析。流式細(xì)胞儀設(shè)門策略參考作者以往報道LS」。

        1.3統(tǒng)計分析使用SPSSll. 5軟件統(tǒng)計分析原始數(shù)據(jù)。參考值范圍采用中位數(shù)(2.5%,97.5%分位數(shù))表示。各組之間的比較采用Mann一}} hitney" U檢驗，與年齡的相關(guān)性采用Spearman's等級相關(guān)檢驗。 P < 0. OS表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義
 

        2結(jié)果
 

        2. 1健康人群、慢性丙型肝炎以及丙型肝炎肝硬化患者外周血淋巴細(xì)胞亞群與年齡的相關(guān)性分析分析健康人群和HCv感染慢性肝炎和肝硬化人群外周血淋巴細(xì)胞亞群頻率與年齡的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)健康人群中，CD3十CD4十T細(xì)胞、CD3' CD16十CD56十NKT細(xì)胞頻率以及CD4/CD8比值與年齡呈顯著正相關(guān)(P< 0.05);而在慢性丙型肝炎人群中，CD3' CD4十T細(xì)胞與年齡呈顯著正相關(guān)，CD3一CD19' B細(xì)胞則與年齡呈顯著負(fù)相關(guān)(P <0.05);在肝硬化人群中，只有CD3 CD16十CD56十NK細(xì)胞頻率與年齡呈顯著正相關(guān)(尸< 0. OS)(表1)。
 

        2. 2不同年齡段人群外周血淋巴細(xì)胞亞群與性別的相關(guān)性分析進(jìn)一步分析不同年齡階段人群外周血淋巴細(xì)胞亞群與性別的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)15 } 49歲的健康男性CD3十T細(xì)胞和CD3' CD4十T細(xì)胞亞群頻率均低于女性;而在該年齡段慢性丙型肝炎患者男性人群中，CD4/CD8比值和CD3+CD4+T細(xì)胞頻率也低于女性。但上述T細(xì)胞亞群在肝硬化患者群體中卻無顯著性別差異，但CD3一CD19 } B細(xì)胞頻率卻在肝硬化男性患者中顯著高于女性患者。類似的發(fā)現(xiàn)同樣發(fā)生在50歲以上健康人及肝硬化人群中:女性人群 CD4/CD8比值顯著高于男性，而CD3十CD8+T細(xì)胞頻率卻顯著低于男性(P<0.05)(表2) o
 

        2. 3不同年齡段人群琳巴細(xì)胞亞群與疾病進(jìn)展的相關(guān)性分析比較不同年齡階段丙型肝炎和肝硬化人群與健康人群間外周淋巴細(xì)胞亞群頻率，發(fā)現(xiàn):在3一14歲人群 中，與健康人相比，慢性肝炎人群CD3一CD16' CD56十 NK細(xì)胞亞群頻率顯著降低(P<0.}5)。在15一49歲人群中，與健康人相比，慢性肝炎及肝硬化患者外周血中CD3十T細(xì)胞、CD3 + CD4' T細(xì)胞、CD3 - CD8十T 細(xì)胞、CD3一CD19' B細(xì)胞亞群頻率以及CD4/CD8比值均顯著升高，而CD3一CD16十CD56十1} K細(xì)胞亞群頻率則顯著降低;并且慢性肝炎患者的CD3 + CD16十 CD56十N KT細(xì)胞亞群頻率較健康人也顯著降低。與慢性肝炎組比較，肝硬化患者CD3一CD19十B細(xì)胞亞群頻率則顯著升高(P<0.05)。在>49歲人群中，與健康人群比較，慢性肝炎及肝硬化患者外周血CD3十 CD4十T細(xì)胞,CD3一CD19' B細(xì)胞亞群頻率均顯著升高，而CD3一CD16' CD56 + }K細(xì)胞亞群頻率則顯著降低;肝硬化患者的CD3 + CD16' CD56十NKT細(xì)胞亞群頻率也顯著降低。與慢性肝炎比較，肝硬化患者中 CD3十CDR十T細(xì)胞、CD3一CD19' B細(xì)胞亞群頻率均顯著升高，CD3 + CD16十CD56' NKT細(xì)胞亞群頻率顯著降低(P<0. OS)(表3)。

        3討論 年齡是影響人體免疫狀態(tài)的重要因素“，有文獻(xiàn)報道重型肝炎中小兒外周血CDR' , CD3' CD4十及         CD3'CD}+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯高于成人a然而健康人外周血淋巴細(xì)胞亞群比例與年齡的相關(guān)性尚不明確。一些研究顯示，C D4十T細(xì)胞數(shù)量隨著年齡增加而增加工。一”」，而另一些研究則發(fā)現(xiàn)，CD3+CD4+T 細(xì)胞數(shù)量隨著年齡增加而減少12一‘3。引起這些差異的原因可能與這些研究分析的人群年齡分布較窄有關(guān)。在本研究中，健康人年齡分布較廣，其外周血 CD3 } CD4十T細(xì)胞和CD3 + CD16' CD56十NKT細(xì)胞頻 率與年齡存在明顯的正相關(guān)關(guān)系;這種正相關(guān)關(guān)系在慢性丙型肝炎患者中仍然存在二作者還發(fā)現(xiàn)，慢性肝炎人群中，CD3一CD19' B細(xì)胞頻率與年齡呈顯著負(fù)相關(guān);而肝硬化患者中，CD3一CD16' CD56 + NK細(xì)胞頻率則與年齡呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果提示，HCV感染可能會打破機體淋巴細(xì)胞的分布平衡，但其具體臨床意義尚不清楚。作者還發(fā)現(xiàn)，HCV感染不同疾病階段(慢性肝炎和代償期肝硬化)外周血淋巴細(xì)胞頻率與性別關(guān)系密切。在15-49歲的健康人及慢性肝炎人群中，女性C D4十T細(xì)胞亞群頻率高于男性;而在肝硬化患者中，女性CD3一CD19十B細(xì)胞頻率低于男性。

        目前，對引起這些差異的因素還不清楚，但越來越多的研究提示，病毒慢性感染疾病轉(zhuǎn)歸與性別的關(guān)系及機體免疫狀態(tài)密切相關(guān)。例如，HIV感染的女性由于漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)活化顯著高于男性，引起疾病進(jìn)展更快‘4。臨床已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HBV和HCV感染后，男性患者疾病進(jìn)展為肝癌較女性更多與白細(xì)胞介素(IL)一6分泌密切相關(guān)15。這些研究提示，性別或許可通過影響機體免疫狀態(tài)而影響疾病進(jìn)展。

        作者還比較了不同年齡階段慢性肝炎、代償期肝硬化與健康人群外周血淋巴細(xì)胞亞群的分布差異發(fā)現(xiàn)在所有年齡的人群中，HCV感染患者的CD3一CD16 CD56' NK細(xì)胞亞群頻率均較正常人顯著降低，而 CD3'CD8'T細(xì)胞頻率則顯著升高。這與以往的研究類似‘7一。近研究也提示，CD3一CD16+CD56+1V-K細(xì)胞減少可能導(dǎo)致CD3十CD8+T細(xì)胞持續(xù)增加。在鼠巨細(xì)胞病毒感染的研究中發(fā)現(xiàn)，CD3一CD16 + CD56 + NK細(xì)胞扮演了重要的地位，其活力的喪失可能會增加CD3' CD8十T細(xì)胞和CD3十CD4+T細(xì)胞的功能，這可能與病毒感染的抗原細(xì)胞持續(xù)刺激有關(guān)’6一。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，在15歲以上人群，CD3一CD19' B細(xì)胞在健康人、慢性肝炎、肝硬化患者中有呈持續(xù)升高的現(xiàn)象，提示B細(xì)胞與肝纖維化關(guān)系密切。既往研究表明，B細(xì)胞可通過對肝組織的損傷與修復(fù)發(fā)揮作用而影響肝纖維化進(jìn)展L1}7。這些結(jié)果提示HCV感染可改變?nèi)梭w淋巴細(xì)胞亞群分布，將來的研究應(yīng)該明確這些變化的淋巴細(xì)胞亞群的臨床意義及相關(guān)的機制。
 

        總之，本研究通過回顧性分析健康人群和HCV 感染不同階段患者淋巴細(xì)胞亞群的分布特點及其與 HCV疾病進(jìn)展、年齡、性另」的關(guān)系，為臨床科學(xué)評價丙型肝炎人群免疫狀態(tài)提供重要的免疫指標(biāo)。

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