【摘要】目的:研究急性髓性白血病病人外周血中腫瘤抑制基因RIZ1的表達(dá)狀況和該基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及兩者之間的關(guān)系。方法:以37例初發(fā)急性髓性白血病病人和15例正常人外周血標(biāo)本為研究對象。RTPCR檢測RIZ1 mRNA水平,甲基化特異性PCR(MSP)檢測RIZ1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果:急性髓性白血病病人標(biāo)本與正常人標(biāo)本比較,RIZ1基因的表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。急性髓性白血病標(biāo)本中RIZ1基因啟動子區(qū)甲基化率為29.7%(11/37)。存在甲基化的急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本中,RIZ1基因表達(dá)缺失或降低。結(jié)論:RIZ1基因表達(dá)下降與急性髓性白血病的發(fā)生有關(guān), 其部分機(jī)制在于基因啟動子區(qū)甲基化。
【關(guān)鍵詞】 急性髓性白血病; RIZ1基因; DNA甲基化
Study on the relationship between the RIZ1 gene ex[x]pression and methylation status of the gene promoter in acute myeloid leukemia YAO Chen1, FANG Juanjuan1, Gao Li li1, DING Jiahua2, SHU Guo fang3, YU Weiping1(1. Department of Pathology and Pathophysiology, School of Medical Science, Southeast University, Nanjing 210009, China; 2. Department of Hematology, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China; 3. Center of Clinical Laboratory Medicine, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China)
[Abstract] ob[x]jective: To investigate the ex[x]pression of RIZ1 gene in acute myeloid leukemia and to analyze the relationship between this alteration and the promoter hypermethylation of RIZ1 gene. Methods: The ex[x]pression of RIZ1 mRNA in peripheral blood from 37 patients of primary acute myeloid leukemia samples and in peripheral blood from 15 normal persons samples was detected by reverse transcripitionpolymerase chain reaction(RTPCR). Methylationspecific PCR(MSP)was used to assay the methylation of RIZ1 gene promotor region. Results: Compared with normal person, the RIZ1 gene ex[x]pression level decreased significantly in acute myeloid leukemia(P<0.05). The Methylation rate was 29.7%(11/37) in acute myeloid leukemia. The ex[x]pression of RIZ1 mRNA was found to be lower in the acute myeloid leukemia samples with RIZ1 promoter methylation. Conclusion: Downregulation of RIZ1 gene ex[x]pression plays an important role in the development of acute myeloid leukemia, and this alteration is partially caused by RIZ1 gene promoter methylation.
[Key words] acute myeloid leukemia; RIZ1gene; DNA methylation
RIZ1是定位于1p36的一個(gè)腫瘤抑制基因, 屬于核蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶超家族成員。RIZ1失活在多數(shù)腫瘤中常見, RIZ1 mRNA表達(dá)下降或缺失常與RIZ1啟動子區(qū)甲基化有關(guān)。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),腫瘤抑制基因RIZ1 mRNA表達(dá)缺乏既見于急性髓性白血病細(xì)胞株AML193又見于慢性髓性白血病細(xì)胞株K562,提示該現(xiàn)象屬于髓性白血病的分子改變之一。采用轉(zhuǎn)基因方法證實(shí)RIZ1具有髓性白血病細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用[1]。本研究收集急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本,對RIZ1 mRNA及其甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測,旨在探討急性髓性白血病病人RIZ1基因的表達(dá)狀況及其甲基化狀態(tài)。
1 材料與方法
1.1 標(biāo)本的來源
37例急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本取自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院血液科發(fā)病初期的病人,其中男21例,女16例,中位年齡44歲。按FAB標(biāo)準(zhǔn)分型:M15例,M211例,M38例,M510例,M63例。15例健康志愿者的外周血標(biāo)本作為正常對照,中位年齡38歲。
1.2 方法
1.2.1 RIZ1 mRNA的檢測 (1) 單個(gè)核細(xì)胞分離與裂解:取肝素抗凝血5~10 ml, 生理鹽水緩沖液稀釋后,用相對密度為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)生理鹽水洗滌后Trizol裂解,-80 ℃保存。(2) 提取總RNA:采用Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)并按其說明操作。通過紫外分光光度計(jì)(HITACH U2001)測RNA純度和濃度。取OD260 nm/OD280 nm值在1.8~2.0范圍內(nèi)的產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。(3) cDNA的合成:按TaKaRa RTPCR試劑盒說明書操作,取2.0 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μl,包含10×RT buffer 2.0 μl,2.5 mmol•L-1 MgCl2 4.0 μl,10 mmol•L-1 dNTP 2.0 μl,Olid(dT)1.0 μl,RNase inhibitor 0.5 μl,AMV 1.0 μl,無RNase水補(bǔ)足反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為:30 ℃ 10 min,42 ℃ 20 min,99 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min。獲得產(chǎn)物置-20 ℃保存。(4) RIZ1基因的擴(kuò)增:以獲得的cDNA為模板通過PCR儀(Eppendoff公司)擴(kuò)增該基因。RIZ1基因引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成。上游序列為5′GAAGT GAGGCTTTTCCCTTCT3′, 下游序列為5′CTCAGGGTTGTCTTCCCCA3′,擴(kuò)增的片段長度為357 bp。以βactin為內(nèi)參,上游序列為5′GCAAGAG
AGGCATCCTCACC3′,下游序列為5′GCACAGCCTGG
ATAGCAACG3′,擴(kuò)增的片段長度為240 bp。以pRIZ1 RH質(zhì)粒(由加拿大Saskatchewan大學(xué)癌癥研究中心提供)為模板作為陽性對照,滅菌去離子水為陰性對照。反應(yīng)體系為50 μl,包含5×PCR buffer 10 μl,20 pmol•L-1上、下游引物各0.5 μl,cDNA 10 μl,Taq DNA聚合酶1 μl,滅菌去離子水補(bǔ)足體系。反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,退火溫度RIZ1 53 ℃/βactin 65 ℃ 30 s,72 ℃1 min,共40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物電泳應(yīng)用FR200紫外可見分析裝置(上海復(fù)日科技有限公司)和smart view TM 2001生物電泳圖像分析軟件對電泳條帶進(jìn)行分析。RIZ1 mRNA相對含量=RIZ1條帶密度/βactin條帶密度。
1.2.2 RIZ1基因甲基化的分析 應(yīng)用DNA提取試劑盒(北京天根公司)及甲基化修飾試劑盒(北京天漠科技開發(fā)有限公司)并按其說明書操作,提取所有標(biāo)本中單個(gè)核細(xì)胞DNA并加以甲基化修飾。采用甲基化特異性PCR(methylationspecific PCR, MSP)法,使用非甲基化與甲基化兩對引物檢測標(biāo)本中RIZ1基因的甲基化狀態(tài)。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[2]報(bào)道,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。非甲基化引物的上游序列為5′TGGTGGTTATTGGGTGATGGT3′,下游序列為5′ACTATTTCACCAACCCCAAGA3′;甲基化引物上游序列為5′GTGGTGGTTATTGGGCGACGGC3′, 下游序列為5′GCTATTTCGCCGACCCCGACG3′;擴(kuò)增的片段長度分別為175 bp和177 bp。PCR反應(yīng)條件:95 ℃10 min,94 ℃ 30 s,退火溫度56 ℃(非甲基化)/68 ℃(甲基化)45 s,72 ℃1 min,共40個(gè)循環(huán);后72 ℃延伸10 min。獲得產(chǎn)物電泳、攝像,并隨機(jī)挑選未甲基化與甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物各1例進(jìn)行測序分析。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件,均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 RIZ1基因mRNA表達(dá)狀況
RTPCR檢測結(jié)果表明,37例急性髓性白血病病人和15例正常對照者外周血標(biāo)本中,RIZ1 mRNA相對含量的平均值分別為0.50±0.20與0.79±0.12,急性髓性白血病病人外周血中RIZ1 mRNA表達(dá)低于正常對照者,差異有顯著性(P<0.05)。其中15例急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本RIZ1 mRNA表達(dá)降低或缺失(圖1)。
M. 100 bp DNA相對分子質(zhì)量Marker; 1. 正常人標(biāo)本; 2. 陰性對照; 3~6. 急性髓性白血病病人標(biāo)本; 7. 陽性對照
圖1 急性髓性白血病病人及正常人外周血標(biāo)本中RIZ1 mRNA表達(dá)狀況
Fig 1 ex[x]pression of RIZ1 mRNA in acute myeloid leukemia and normal samples2.2 RIZ1啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)
MSP法分析表明,37例急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本中11例存在RIZ1啟動子區(qū)甲基化,甲基化率為29.7%(11/37)。15例正常人外周血標(biāo)本均為非甲基化。圖2顯示部分標(biāo)本檢測結(jié)果,在急性髓性白血病標(biāo)本中,3、4、12和21號標(biāo)本擴(kuò)增出175 bp的U片斷和177 bp的M片斷,說明存在RIZ1啟動子區(qū)甲基化;而9和15號標(biāo)本僅擴(kuò)增出175 bp的U片斷,說明RIZ1啟動子區(qū)未甲基化;8號正常標(biāo)本只擴(kuò)增出175 bp的U片斷,也說明RIZ1啟動子區(qū)未甲基化。
Marker. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)記; M. 甲基化條帶(177 bp); U. 未甲基化條帶(175 bp); 1、2、3、5、6、7. 3、4、9、15、12和21號病人標(biāo)本; 4. 8號正常標(biāo)本
圖2 急性髓性白血病病人及正常人外周血標(biāo)本中RIZ1基因甲基化狀態(tài)
Fig 2 Methylation status of RIZ1 gene in acute myeloid leukemic and normal samples2.3 MSP產(chǎn)物測序分析
隨機(jī)挑選未甲基化與甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物各1例進(jìn)行測序,結(jié)果與GenBank中RIZ1基因啟動子區(qū)的序列作對比,可見未甲基化產(chǎn)物中的胞嘧啶全部替換為胸腺嘧啶,未甲基化序列中的C經(jīng)修飾則轉(zhuǎn)變?yōu)門;而甲基化產(chǎn)物所有CpG對應(yīng)的胞嘧啶均保持不變,CpG以外的胞嘧啶則替換為胸腺嘧啶,從而證實(shí)受檢MSP產(chǎn)物是RIZ1基因啟動子區(qū)的部分序列,甲基化序列中CpG的C未被硫化,仍為C。換言之,MSP產(chǎn)物測序結(jié)果中,存在CpG表明CpG甲基化,存在TpG表明CpG未甲基化(圖3)。因此,該測序結(jié)果表明本研究中MSP法分析可靠。
N(GenBank:AF472587.1 61-961)
TCCG AC TG G AGTC A A GA TGG CGG CGG CG CGG
A. 4號未甲基化樣本測序結(jié)果
N(GenBank:AF472587.1 61-961)
TCCG ACTGG AGTC A AGA TG G CGG CGG CG CGG
B. 12號甲基化樣本測序結(jié)果
圖3 RIZ1基因啟動子區(qū)未甲基化與甲基化樣本的測序結(jié)果
Fig 3 Sequencing results of RIZ1 gene promoter unmethylation and methylation samples2.4 RIZ1啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)的相關(guān)性
在RIZ1表達(dá)降低或缺失的15例急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本中, 11例存在RIZ1啟動子區(qū)甲基化,甲基化率為73.3%(11/15)。在37例急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本中,甲基化率為29.7%(11/37)。11例RIZ1啟動子區(qū)甲基化的急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本的RIZ1 mRNA相對含量的平均值為0.40±0.22;26例RIZ1啟動子區(qū)未甲基化的急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本的RIZ1 mRNA相對含量平均值為0.54±0.18,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明急性髓性白血病病人外周血中RIZ1啟動子區(qū)甲基化者mRNA表達(dá)水平低于啟動子區(qū)未甲基化者。
3 討 論
人類多種癌癥如胃癌、肝癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌及骨肉瘤等,RIZ1表達(dá)缺失[3-5]。方娟娟等[6]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者組織中存在RIZ1基因表達(dá)的改變,提示RIZ1減少與乳腺癌發(fā)病有關(guān)。大量研究證明RIZ1表達(dá)改變與RIZ1啟動子區(qū)甲基化有關(guān),故我們進(jìn)一步觀察了急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本中RIZ1基因表達(dá)及其甲基化狀況,探討RIZ1基因與急性髓性白血病的關(guān)系,以期RIZ1可成為其失活的急性髓性白血病病人有效的治療靶點(diǎn)。
本研究發(fā)現(xiàn),RIZ1基因在正常人外周血中均有表達(dá),其mRNA相對含量平均值為0.79±0.12,而急性髓性白血病者為0.50±0.20,低于正常水平(P<0.05)。其中40.5%(15/37)的急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本RIZ1表達(dá)降低或缺失,表明RIZ1表達(dá)改變是急性髓性白血病的常見現(xiàn)象。
DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)上研究深入的一種機(jī)制,是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段,DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)以S腺苷甲硫氨酸為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移到DNA上胞嘧啶5碳位置,形成CpG位點(diǎn)。在大多數(shù)哺乳動物中,DNA甲基化多位于基因CpG島中[7]。啟動子區(qū)CpG島處于未甲基化狀態(tài)的基因能正常表達(dá),而其甲基化常導(dǎo)致基因表達(dá)沉默,盡管基因序列沒有改變,這是多種腫瘤細(xì)胞中腫瘤抑制基因功能喪失的重要機(jī)制[8]。Akahira等[9]研究發(fā)現(xiàn)RIZ1表達(dá)下降與上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),認(rèn)為這種表達(dá)改變的部分原因在于異常DNA甲基化。Piao等[10]也發(fā)現(xiàn)RIZ1啟動子區(qū)甲基化引起該基因失活在肝癌發(fā)生特別是其早期階段具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)29.7%(11/37)的急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本存在RIZ1啟動子區(qū)甲基化,并同時(shí)都存在RIZ1 mRNA表達(dá)下降或缺失,提示兩者密切關(guān)聯(lián)。在15例RIZ1基因表達(dá)降低或缺失的病人外周血標(biāo)本中,4例未發(fā)現(xiàn)RIZ1基因啟動子區(qū)甲基化,表明急性髓性白血病中RIZ1基因啟動子區(qū)甲基化并不是表達(dá)改變的原因,此時(shí)可能存在其他失活的機(jī)制。
在腫瘤中高頻率出現(xiàn)的甲基化基因可以作為臨床診斷、病程監(jiān)控的分子標(biāo)志物。腫瘤中DNA甲基化改變與臨床表現(xiàn)具有潛在的關(guān)聯(lián),這種變化是微小轉(zhuǎn)移的一個(gè)敏感指標(biāo),對預(yù)后判斷具有一定價(jià)值。既然RIZ1基因的表達(dá)缺失與其DNA甲基化有關(guān),那么修正基因的甲基化狀態(tài)就有可能成為一新的腫瘤治療途徑。由于DNA甲基化現(xiàn)象是一種可逆性變化, 而該基因是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一,目前已經(jīng)有人采用甲基化抑制劑5Azadc或其衍生物處理甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活的腫瘤細(xì)胞,可使啟動子區(qū)DNA去甲基化,恢復(fù)腫瘤細(xì)胞抑癌基因表達(dá),使其去甲基化而被激活,在臨床上已取得一定進(jìn)展[11]。但DNA甲基化不是使其失活的因素,應(yīng)進(jìn)一步研究如何增強(qiáng)RIZ1基因的有效表達(dá)及其他導(dǎo)致其沉默的機(jī)制,以期為急性髓性白血病的治療提供新的前景。
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