急性髓性白血病病人外周血中RIZ1的表達(dá)變化與啟動子區(qū)甲

　　【摘要】目的：研究急性髓性白血病病人外周血中腫瘤抑制基因RIZ1的表達(dá)狀況和該基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及兩者之間的關(guān)系。方法：以37例初發(fā)急性髓性白血病病人和15例正常人外周血標(biāo)本為研究對象。RTPCR檢測RIZ1 mRNA水平,甲基化特異性PCR(MSP)檢測RIZ1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果:急性髓性白血病病人標(biāo)本與正常人標(biāo)本比較,RIZ1基因的表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。急性髓性白血病標(biāo)本中RIZ1基因啟動子區(qū)甲基化率為29.7%(11/37)。存在甲基化的急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本中,RIZ1基因表達(dá)缺失或降低。結(jié)論：RIZ1基因表達(dá)下降與急性髓性白血病的發(fā)生有關(guān), 其部分機(jī)制在于基因啟動子區(qū)甲基化。
　　【關(guān)鍵詞】 急性髓性白血病; RIZ1基因; DNA甲基化
　　Study on the relationship between the RIZ1 gene ex[x]pression and methylation　status of the gene promoter in acute myeloid leukemia　YAO Chen1, FANG Juanjuan1, Gao Li li1, DING Jiahua2,　SHU Guo fang3, YU Weiping1(1. Department of Pathology and Pathophysiology, School of Medical Science, Southeast University, Nanjing 210009,　China; 2. Department of Hematology, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China; 3. Center　of Clinical Laboratory Medicine, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China)

　　[Abstract] ob[x]jective: To investigate the ex[x]pression of RIZ1 gene in acute myeloid leukemia and to analyze the relationship between this alteration and the promoter hypermethylation of RIZ1 gene. Methods: The ex[x]pression of RIZ1 mRNA in peripheral blood from 37 patients of primary acute myeloid leukemia samples and in peripheral blood from 15 normal persons samples was detected by reverse transcripitionpolymerase chain reaction(RTPCR). Methylationspecific PCR(MSP)was used to assay the methylation of RIZ1 gene promotor region. Results: Compared with normal person, the RIZ1 gene ex[x]pression level decreased significantly in acute myeloid leukemia(P<0.05). The Methylation rate was 29.7%(11/37) in acute myeloid leukemia. The ex[x]pression of RIZ1 mRNA was found to be lower in the acute myeloid leukemia samples with RIZ1 promoter methylation. Conclusion: Downregulation of RIZ1 gene ex[x]pression plays an important role in the development of acute myeloid leukemia, and this alteration is partially caused by RIZ1 gene promoter methylation.

　　[Key words] acute myeloid leukemia; RIZ1gene; DNA methylation

　　RIZ1是定位于1p36的一個(gè)腫瘤抑制基因, 屬于核蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶超家族成員。RIZ1失活在多數(shù)腫瘤中常見, RIZ1 mRNA表達(dá)下降或缺失常與RIZ1啟動子區(qū)甲基化有關(guān)。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),腫瘤抑制基因RIZ1 mRNA表達(dá)缺乏既見于急性髓性白血病細(xì)胞株AML193又見于慢性髓性白血病細(xì)胞株K562,提示該現(xiàn)象屬于髓性白血病的分子改變之一。采用轉(zhuǎn)基因方法證實(shí)RIZ1具有髓性白血病細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用[1]。本研究收集急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本,對RIZ1 mRNA及其甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測,旨在探討急性髓性白血病病人RIZ1基因的表達(dá)狀況及其甲基化狀態(tài)。
　　1 材料與方法
　　1.1 標(biāo)本的來源
　　37例急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本取自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院血液科發(fā)病初期的病人,其中男21例,女16例,中位年齡44歲。按FAB標(biāo)準(zhǔn)分型：M15例,M211例,M38例,M510例,M63例。15例健康志愿者的外周血標(biāo)本作為正常對照,中位年齡38歲。
　　1.2 方法

　　1.2.1 RIZ1 mRNA的檢測 (1) 單個(gè)核細(xì)胞分離與裂解：取肝素抗凝血5～10 ml, 生理鹽水緩沖液稀釋后,用相對密度為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)生理鹽水洗滌后Trizol裂解,-80 ℃保存。(2) 提取總RNA：采用Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)并按其說明操作。通過紫外分光光度計(jì)(HITACH U2001)測RNA純度和濃度。取OD260 nm/OD280 nm值在1.8～2.0范圍內(nèi)的產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。(3) cDNA的合成：按TaKaRa RTPCR試劑盒說明書操作,取2.0 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μl,包含10×RT buffer 2.0 μl,2.5 mmol•L-1 MgCl2 4.0 μl,10 mmol•L-1 dNTP 2.0 μl,Olid(dT)1.0 μl,RNase inhibitor 0.5 μl,AMV 1.0 μl,無RNase水補(bǔ)足反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：30 ℃ 10 min,42 ℃ 20 min,99 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min。獲得產(chǎn)物置-20 ℃保存。(4) RIZ1基因的擴(kuò)增：以獲得的cDNA為模板通過PCR儀(Eppendoff公司)擴(kuò)增該基因。RIZ1基因引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成。上游序列為5′GAAGT GAGGCTTTTCCCTTCT3′, 下游序列為5′CTCAGGGTTGTCTTCCCCA3′,擴(kuò)增的片段長度為357 bp。以βactin為內(nèi)參,上游序列為5′GCAAGAG

　　AGGCATCCTCACC3′,下游序列為5′GCACAGCCTGG

　　ATAGCAACG3′,擴(kuò)增的片段長度為240 bp。以pRIZ1 RH質(zhì)粒(由加拿大Saskatchewan大學(xué)癌癥研究中心提供)為模板作為陽性對照,滅菌去離子水為陰性對照。反應(yīng)體系為50 μl,包含5×PCR buffer 10 μl,20 pmol•L-1上、下游引物各0.5 μl,cDNA 10 μl,Taq DNA聚合酶1 μl,滅菌去離子水補(bǔ)足體系。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,退火溫度RIZ1 53 ℃/βactin 65 ℃ 30 s,72 ℃1 min,共40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物電泳應(yīng)用FR200紫外可見分析裝置(上海復(fù)日科技有限公司)和smart view TM 2001生物電泳圖像分析軟件對電泳條帶進(jìn)行分析。RIZ1 mRNA相對含量=RIZ1條帶密度/βactin條帶密度。
　　1.2.2 RIZ1基因甲基化的分析 應(yīng)用DNA提取試劑盒(北京天根公司)及甲基化修飾試劑盒(北京天漠科技開發(fā)有限公司)并按其說明書操作,提取所有標(biāo)本中單個(gè)核細(xì)胞DNA并加以甲基化修飾。采用甲基化特異性PCR(methylationspecific PCR, MSP)法,使用非甲基化與甲基化兩對引物檢測標(biāo)本中RIZ1基因的甲基化狀態(tài)。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[2]報(bào)道,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。非甲基化引物的上游序列為5′TGGTGGTTATTGGGTGATGGT3′,下游序列為5′ACTATTTCACCAACCCCAAGA3′;甲基化引物上游序列為5′GTGGTGGTTATTGGGCGACGGC3′, 下游序列為5′GCTATTTCGCCGACCCCGACG3′;擴(kuò)增的片段長度分別為175 bp和177 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃10 min,94 ℃ 30 s,退火溫度56 ℃(非甲基化)/68 ℃(甲基化)45 s,72 ℃1 min,共40個(gè)循環(huán);后72 ℃延伸10 min。獲得產(chǎn)物電泳、攝像,并隨機(jī)挑選未甲基化與甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物各1例進(jìn)行測序分析。
　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件,均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2 結(jié) 果
　　2.1 RIZ1基因mRNA表達(dá)狀況

　　RTPCR檢測結(jié)果表明,37例急性髓性白血病病人和15例正常對照者外周血標(biāo)本中,RIZ1 mRNA相對含量的平均值分別為0.50±0.20與0.79±0.12,急性髓性白血病病人外周血中RIZ1 mRNA表達(dá)低于正常對照者,差異有顯著性(P<0.05)。其中15例急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本RIZ1 mRNA表達(dá)降低或缺失(圖1)。
　　M. 100 bp DNA相對分子質(zhì)量Marker; 1. 正常人標(biāo)本; 2. 陰性對照; 3～6. 急性髓性白血病病人標(biāo)本; 7. 陽性對照
　　圖1 急性髓性白血病病人及正常人外周血標(biāo)本中RIZ1 mRNA表達(dá)狀況

　　Fig 1 ex[x]pression of RIZ1 mRNA in acute myeloid leukemia and normal samples2.2 RIZ1啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)
　　MSP法分析表明,37例急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本中11例存在RIZ1啟動子區(qū)甲基化,甲基化率為29.7%(11/37)。15例正常人外周血標(biāo)本均為非甲基化。圖2顯示部分標(biāo)本檢測結(jié)果,在急性髓性白血病標(biāo)本中,3、4、12和21號標(biāo)本擴(kuò)增出175 bp的U片斷和177 bp的M片斷,說明存在RIZ1啟動子區(qū)甲基化;而9和15號標(biāo)本僅擴(kuò)增出175 bp的U片斷,說明RIZ1啟動子區(qū)未甲基化;8號正常標(biāo)本只擴(kuò)增出175 bp的U片斷,也說明RIZ1啟動子區(qū)未甲基化。
　　Marker. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)記; M. 甲基化條帶(177 bp); U. 未甲基化條帶(175 bp); 1、2、3、5、6、7. 3、4、9、15、12和21號病人標(biāo)本; 4. 8號正常標(biāo)本
　　圖2 急性髓性白血病病人及正常人外周血標(biāo)本中RIZ1基因甲基化狀態(tài)
　　Fig 2 Methylation status of RIZ1 gene in acute myeloid leukemic and normal samples2.3 MSP產(chǎn)物測序分析

　　隨機(jī)挑選未甲基化與甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物各1例進(jìn)行測序,結(jié)果與GenBank中RIZ1基因啟動子區(qū)的序列作對比,可見未甲基化產(chǎn)物中的胞嘧啶全部替換為胸腺嘧啶,未甲基化序列中的C經(jīng)修飾則轉(zhuǎn)變?yōu)門;而甲基化產(chǎn)物所有CpG對應(yīng)的胞嘧啶均保持不變,CpG以外的胞嘧啶則替換為胸腺嘧啶,從而證實(shí)受檢MSP產(chǎn)物是RIZ1基因啟動子區(qū)的部分序列,甲基化序列中CpG的C未被硫化,仍為C。換言之,MSP產(chǎn)物測序結(jié)果中,存在CpG表明CpG甲基化,存在TpG表明CpG未甲基化(圖3)。因此,該測序結(jié)果表明本研究中MSP法分析可靠。
　　N(GenBank:AF472587.1 61-961)

　　TCCG AC TG G AGTC A A GA TGG CGG CGG CG CGG

　　A. 4號未甲基化樣本測序結(jié)果
　　N(GenBank:AF472587.1 61-961)

　　TCCG ACTGG AGTC A AGA TG G CGG CGG CG CGG

　　B. 12號甲基化樣本測序結(jié)果

　　圖3 RIZ1基因啟動子區(qū)未甲基化與甲基化樣本的測序結(jié)果
　　Fig 3 Sequencing results of RIZ1 gene promoter unmethylation and methylation samples2.4 RIZ1啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)的相關(guān)性
　　在RIZ1表達(dá)降低或缺失的15例急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本中, 11例存在RIZ1啟動子區(qū)甲基化,甲基化率為73.3%(11/15)。在37例急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本中,甲基化率為29.7%(11/37)。11例RIZ1啟動子區(qū)甲基化的急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本的RIZ1 mRNA相對含量的平均值為0.40±0.22;26例RIZ1啟動子區(qū)未甲基化的急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本的RIZ1 mRNA相對含量平均值為0.54±0.18,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明急性髓性白血病病人外周血中RIZ1啟動子區(qū)甲基化者mRNA表達(dá)水平低于啟動子區(qū)未甲基化者。
　　3 討 論
　　人類多種癌癥如胃癌、肝癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌及骨肉瘤等,RIZ1表達(dá)缺失[3-5]。方娟娟等[6]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者組織中存在RIZ1基因表達(dá)的改變,提示RIZ1減少與乳腺癌發(fā)病有關(guān)。大量研究證明RIZ1表達(dá)改變與RIZ1啟動子區(qū)甲基化有關(guān),故我們進(jìn)一步觀察了急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本中RIZ1基因表達(dá)及其甲基化狀況,探討RIZ1基因與急性髓性白血病的關(guān)系,以期RIZ1可成為其失活的急性髓性白血病病人有效的治療靶點(diǎn)。
　　本研究發(fā)現(xiàn),RIZ1基因在正常人外周血中均有表達(dá),其mRNA相對含量平均值為0.79±0.12,而急性髓性白血病者為0.50±0.20,低于正常水平(P<0.05)。其中40.5%(15/37)的急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本RIZ1表達(dá)降低或缺失,表明RIZ1表達(dá)改變是急性髓性白血病的常見現(xiàn)象。
　　DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)上研究深入的一種機(jī)制,是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段,DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)以S腺苷甲硫氨酸為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移到DNA上胞嘧啶5碳位置,形成CpG位點(diǎn)。在大多數(shù)哺乳動物中,DNA甲基化多位于基因CpG島中[7]。啟動子區(qū)CpG島處于未甲基化狀態(tài)的基因能正常表達(dá),而其甲基化常導(dǎo)致基因表達(dá)沉默,盡管基因序列沒有改變,這是多種腫瘤細(xì)胞中腫瘤抑制基因功能喪失的重要機(jī)制[8]。Akahira等[9]研究發(fā)現(xiàn)RIZ1表達(dá)下降與上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),認(rèn)為這種表達(dá)改變的部分原因在于異常DNA甲基化。Piao等[10]也發(fā)現(xiàn)RIZ1啟動子區(qū)甲基化引起該基因失活在肝癌發(fā)生特別是其早期階段具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)29.7%(11/37)的急性髓性白血病病人外周血標(biāo)本存在RIZ1啟動子區(qū)甲基化,并同時(shí)都存在RIZ1 mRNA表達(dá)下降或缺失,提示兩者密切關(guān)聯(lián)。在15例RIZ1基因表達(dá)降低或缺失的病人外周血標(biāo)本中,4例未發(fā)現(xiàn)RIZ1基因啟動子區(qū)甲基化,表明急性髓性白血病中RIZ1基因啟動子區(qū)甲基化并不是表達(dá)改變的原因,此時(shí)可能存在其他失活的機(jī)制。
　　在腫瘤中高頻率出現(xiàn)的甲基化基因可以作為臨床診斷、病程監(jiān)控的分子標(biāo)志物。腫瘤中DNA甲基化改變與臨床表現(xiàn)具有潛在的關(guān)聯(lián),這種變化是微小轉(zhuǎn)移的一個(gè)敏感指標(biāo),對預(yù)后判斷具有一定價(jià)值。既然RIZ1基因的表達(dá)缺失與其DNA甲基化有關(guān),那么修正基因的甲基化狀態(tài)就有可能成為一新的腫瘤治療途徑。由于DNA甲基化現(xiàn)象是一種可逆性變化, 而該基因是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一,目前已經(jīng)有人采用甲基化抑制劑5Azadc或其衍生物處理甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活的腫瘤細(xì)胞,可使啟動子區(qū)DNA去甲基化,恢復(fù)腫瘤細(xì)胞抑癌基因表達(dá),使其去甲基化而被激活,在臨床上已取得一定進(jìn)展[11]。但DNA甲基化不是使其失活的因素,應(yīng)進(jìn)一步研究如何增強(qiáng)RIZ1基因的有效表達(dá)及其他導(dǎo)致其沉默的機(jī)制,以期為急性髓性白血病的治療提供新的前景。
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