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MAL基因在原發(fā)食管癌組織表達及臨床意義

文章來源:創(chuàng)新醫(yī)學網發(fā)布日期:2012-07-02瀏覽次數:36446

 
  作者:陳皓  作者單位:泰安市中心醫(yī)院腫瘤外科,山東 泰安 271000


  THE ex[x]pression AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF MAL GENE IN PRIMARY ESOPHAGUS CANCER CHEN HAO (Department of Oncology, Taian Central Hospital, Taian 271000, China)

  [ABSTRACT] ob[x]jective To explore the relevance between MAL gene ex[x]pression, clinical stage and histologic grade of esophagus cancer. Methods The MAL gene ex[x]pression in 45 cancer patients was detected with RT-PCR and semi-quantitative RT-PCR technique. Results The mRNA ex[x]pression of MAL in 40 cancer tissue samples was lower than that in the surrounding esophagus mucous membrane (χ2=30.59,P<0.01). The gene ex[x]pression in stages Ⅰ and Ⅱ patients was higher than that in stage Ⅲ patients (t=5.952,P<0.001). Those with lymph node me[x]tastasis showed lower gene ex[x]pression than patients without (t=6.743,P<0.001). Conclusion In esophagus cancer, the MAL gene ex[x]pression was associated with histologic grade and clinical stage, which can be used for determining tumor malignancy and predicting its prognosis.

  [KEY WORDS] Esophageal neoplasms; MAL gene; Reverse transc[x]riptase polymerase chain reaction

  MAL基因是由ALONSO等[1]于1987年分離得到的抑制腫瘤生長的新基因,MAL基因失活及異常與細胞信號轉導、腫瘤的發(fā)生發(fā)展和臨床預后等有一定關系。近年來,MAL基因與食管癌的關系已成為研究的熱點。本研究利用定性和半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測食管癌組織及其癌旁組織中MAL基因的表達情況,旨在探討MAL基因在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用,及其與臨床病理因素的關系,為食管癌發(fā)病機制的研究提供新思路。

  1 材料與方法

  1.1 標本來源

  1.1.1 病例選擇 2004年6月~2006年3月,泰安市中心醫(yī)院住院的食管癌病人45例,男25例,女20例;年齡36~79歲,平均57.5歲。術前均未發(fā)現(xiàn)遠處轉移,未行放、化療治療。手術方式均為經左胸行食管癌次全切除胃-食管弓上或弓下吻合術,術中無肉眼可見腫瘤殘留。術后病理檢查均證實為鱗癌。按UICC食管癌分期標準(1997)進行分期。

  1.1.2 標本取材和保存 食管癌組織及癌旁組織取自食管癌病人手術標本,組織離體后立即無菌取材,從腫瘤生長活躍無壞死的部位取下約1 cm3癌組織及5 cm外癌旁組織,標本30 min內送實驗室,新鮮提取總RNA;不能保證30 min內制備樣品的,在取材后放-80 ℃冰箱保存?zhèn)錅y。

  1.2 檢測方法

  采用半定量RT-PCR法檢測MAL mRNA的相對表達水平。①總RNA提?。翰捎肨rizol提取總RNA,并進行純度和濃度測定。②RT反應:于DEPC處理的Eppendorf管中,加入1 μg總RNA、MMLV及隨機引物等,快速離心混勻后,37 ℃ 1 h,95 ℃ 10 min滅活MMLV,快速離心使蒸氣沉于管底。③PCR反應:于0.5 mL Eppendorf管中加入RT反應產物、PCR反應體系、MAL上游引物(5′-AAGATCCTCTGCTGACCCCT-3′)、MAL下游引物(5′-ACCATGGACCTCTGGAAAGA-3′)、β-actin上游引物(5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′),以及β-actin下游引物(5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′),擴增片段長度為500 bp;95 ℃ 5 min,離心使蒸氣沉于管底,加Taq DNA聚合酶,快速離心混勻。循環(huán)條件:94 ℃ 1 min,58 ℃1 min,72 ℃ 1 min,循環(huán)35次,末次延伸7 min。電泳鑒定,觀察目的基因,實驗中僅出現(xiàn)一條500 bp β-actin條帶為MAL mRNA陰性;同時出現(xiàn)166 bp條帶為MAL mRNA陽性。采用數字圖像分析儀2200系統(tǒng)觀察拍照并進行半定量分析,以MAL/β-actin比值作為MAL mRNA相對表達量,若比值小于25%為表達缺失,若比值小于50%則為低表達,低表達與表達缺失均為異常表達。

  1.3 統(tǒng)計學分析

  應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件,對定性RT-PCR結果進行χ2檢驗及確切概率法;對半定量RT-PCR結果進行t檢驗。

  2 結 果

  2.1 食管癌組織和癌旁組織中MAL mRNA的定性檢查結果比較

  45例食管癌組織中未見MAL表達者28例,弱表達者12例;癌旁組織食管黏膜組織MAL mRNA全部呈陽性表達。食管癌組織中MAL mRNA表達明顯低于相應的癌旁食管黏膜組織,差異有顯著性(χ2=30.59,P<0.01)。見圖1。

  圖1 RT-PCR檢測食管癌組織MAL mRNA的表達

 ?、?、②為食管癌組織MAL mRNA表達陽性;③、④為食管癌組織MAL mRNA表達陰性;⑤為X174/HaeⅢ分子質量標志物

  2.2 MAL mRNA的半定量RT-PCR檢測

  2.2.1 食管癌組織和癌旁組織中MAL mRNA表達水平比較 本文45例食管癌組織MAL mRNA相對表達水平為0.90±0.11,而癌旁組織中MAL mRNA的表達水平為1.51±0.27,兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(t=2.329,P<0.05)。

  2.2.2 食管癌組織MAL mRNA表達水平與臨床病理分期的關系 MAL mRNA表達水平與食管癌病人性別、年齡無關,但隨臨床分期的增高,其表達水平明顯降低(P<0.001),且淋巴結轉移陽性者MAL mRNA表達水平顯著低于淋巴結轉移陰性者(P<0.001)。見表1。表1 食管癌組織MAL mRNA表達水平與臨床病理特征的關系

  3 討 論

  MAL基因定位于2q13,共含有4個外顯子,其cDNA長為1 051 bp。MAL是T淋巴細胞成熟相關蛋白,它強烈表達于正常食管上皮細胞,1987年ALONSO等[1]報道具有特征性的MAL cDNA克隆呈現(xiàn)在成熟T淋巴細胞上。現(xiàn)已證實,MAL是組成向頂端運輸的細胞膜和分泌性蛋白的必不可少的組成部分[2~6]?;贛AL的功能是誘發(fā)廣泛的大量囊泡形成,有作者提出,MAL在頂端傳送體的形成中扮演著重要角色[7,8]?,F(xiàn)在已有許多研究證明,MAL表達和人類食管惡性腫瘤相關。有學者報道,MAL基因在食管癌發(fā)生的不同階段均表達下調,且從不同角度分析和探討MAL基因表達下調的可能機制,MAL的不表達或表達下調在食管癌發(fā)生中可能起決定性作用[9,10]。

  TUGORES等[11]報道,MAL啟動子區(qū)設計缺失影響轉錄子失活,沒有觀察到MAL基因組區(qū)有遺傳性的修改,而且在13例食管癌細胞株中有3例MAL啟動子發(fā)生甲基化,9例細胞株中MAL表達正調節(jié)。其機制可能為MAL啟動子DNA甲基化和組蛋白脫乙酰基協(xié)同作用于MAL基因導致腫瘤發(fā)生。然而,現(xiàn)在仍沒有明確MAL基因在癌組織中表達是否被其他機制調節(jié),如染色體缺失、突變或其他畸變。功能性測定表明,在癌細胞中外源性MAL的表達可引起細胞運動性降低,在活體內致瘤性下降。本研究采用定性和半定量兩種方法研究了食管癌MAL mRNA的表達與性別、年齡、臨床分期及組織學分級等因素的關系。結果顯示,MAL mRNA的表達缺失在不同性別、年齡中無明顯差異,從而推測食管癌MAL mRNA的表達缺失與性別、年齡無關,而MAL基因的表達與食管癌的組織學分級、臨床分期也無相關性,與文獻[12,13]報道不符,可能與病例數較少有關。本文研究結果顯示,食管癌組織 MAL mRNA相對表達量與癌旁組織比較差異有顯著性,且隨臨床分期和組織學分級的增高,其表達水平明顯降低,即MAL基因在食管癌組織中表達顯著下調。表明MAL基因表達下調是食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的一個頻發(fā)事件。國內許智雄等[14]通過PCR分析顯示,在食管癌細胞系EC109、EC8712和EC9706中都存在被分析的MAL基因片段。

  本文在研究食管癌組織MAL基因的表達同時,也探討了MAL基因與食管癌淋巴結轉移的關系。結果顯示,淋巴結轉移陽性組MAL的表達顯著低于淋巴結轉移陰性組(P<0.05),提示食管癌組織MAL的低表達與淋巴結轉移存在顯著的相關性,關于MAL基因如何調節(jié)食管癌淋巴轉移的機制仍不十分清楚。淋巴結轉移是食管癌的獨立危險因素,MAL的低表達與淋巴結轉移存在顯著的相關性,因此,MAL基因的表達與食管癌的預后有一定的相關性。目前,關于食管癌MAL基因與淋巴結轉移的關系的同類研究尚未見報道,要得到更加準確和客觀的結果還需要更大樣本量的研究。