MAL基因在原發(fā)食管癌組織表達(dá)及臨床意義

 
　　作者：陳皓　　作者單位：泰安市中心醫(yī)院腫瘤外科，山東 泰安 271000


　　THE ex[x]pression AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF MAL GENE IN PRIMARY ESOPHAGUS CANCER CHEN HAO (Department of Oncology, Taian Central Hospital, Taian 271000, China)

　　[ABSTRACT] ob[x]jective To explore the relevance between MAL gene ex[x]pression, clinical stage and histologic grade of esophagus cancer. Methods The MAL gene ex[x]pression in 45 cancer patients was detected with RT-PCR and semi-quantitative RT-PCR technique. Results The mRNA ex[x]pression of MAL in 40 cancer tissue samples was lower than that in the surrounding esophagus mucous membrane (χ2=30.59,P<0.01). The gene ex[x]pression in stages Ⅰ and Ⅱ patients was higher than that in stage Ⅲ patients (t=5.952,P<0.001). Those with lymph node me[x]tastasis showed lower gene ex[x]pression than patients without (t=6.743,P<0.001). Conclusion In esophagus cancer, the MAL gene ex[x]pression was associated with histologic grade and clinical stage, which can be used for determining tumor malignancy and predicting its prognosis.

　　[KEY WORDS] Esophageal neoplasms; MAL gene; Reverse transc[x]riptase polymerase chain reaction

　　MAL基因是由ALONSO等[1]于1987年分離得到的抑制腫瘤生長(zhǎng)的新基因，MAL基因失活及異常與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展和臨床預(yù)后等有一定關(guān)系。近年來(lái)，MAL基因與食管癌的關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)。本研究利用定性和半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)食管癌組織及其癌旁組織中MAL基因的表達(dá)情況，旨在探討MAL基因在食管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，及其與臨床病理因素的關(guān)系，為食管癌發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路。

　　1 材料與方法

　　1.1 標(biāo)本來(lái)源

　　1.1.1 病例選擇 2004年6月~2006年3月，泰安市中心醫(yī)院住院的食管癌病人45例，男25例，女20例;年齡36～79歲，平均57.5歲。術(shù)前均未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，未行放、化療治療。手術(shù)方式均為經(jīng)左胸行食管癌次全切除胃-食管弓上或弓下吻合術(shù)，術(shù)中無(wú)肉眼可見(jiàn)腫瘤殘留。術(shù)后病理檢查均證實(shí)為鱗癌。按UICC食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)(1997)進(jìn)行分期。

　　1.1.2 標(biāo)本取材和保存 食管癌組織及癌旁組織取自食管癌病人手術(shù)標(biāo)本，組織離體后立即無(wú)菌取材，從腫瘤生長(zhǎng)活躍無(wú)壞死的部位取下約1 cm3癌組織及5 cm外癌旁組織，標(biāo)本30 min內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，新鮮提取總RNA;不能保證30 min內(nèi)制備樣品的，在取材后放-80 ℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)。

　　1.2 檢測(cè)方法

　　采用半定量RT-PCR法檢測(cè)MAL mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。①總RNA提?。翰捎肨rizol提取總RNA，并進(jìn)行純度和濃度測(cè)定。②RT反應(yīng):于DEPC處理的Eppendorf管中，加入1 μg總RNA、MMLV及隨機(jī)引物等，快速離心混勻后，37 ℃ 1 h，95 ℃ 10 min滅活MMLV，快速離心使蒸氣沉于管底。③PCR反應(yīng)：于0.5 mL Eppendorf管中加入RT反應(yīng)產(chǎn)物、PCR反應(yīng)體系、MAL上游引物(5′-AAGATCCTCTGCTGACCCCT-3′)、MAL下游引物(5′-ACCATGGACCTCTGGAAAGA-3′)、β-actin上游引物(5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′)，以及β-actin下游引物(5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為500 bp;95 ℃ 5 min，離心使蒸氣沉于管底，加Taq DNA聚合酶，快速離心混勻。循環(huán)條件：94 ℃ 1 min，58 ℃1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次，末次延伸7 min。電泳鑒定，觀察目的基因，實(shí)驗(yàn)中僅出現(xiàn)一條500 bp β-actin條帶為MAL mRNA陰性;同時(shí)出現(xiàn)166 bp條帶為MAL mRNA陽(yáng)性。采用數(shù)字圖像分析儀2200系統(tǒng)觀察拍照并進(jìn)行半定量分析，以MAL/β-actin比值作為MAL mRNA相對(duì)表達(dá)量，若比值小于25%為表達(dá)缺失，若比值小于50%則為低表達(dá)，低表達(dá)與表達(dá)缺失均為異常表達(dá)。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)定性RT-PCR結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及確切概率法;對(duì)半定量RT-PCR結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 食管癌組織和癌旁組織中MAL mRNA的定性檢查結(jié)果比較

　　45例食管癌組織中未見(jiàn)MAL表達(dá)者28例，弱表達(dá)者12例;癌旁組織食管黏膜組織MAL mRNA全部呈陽(yáng)性表達(dá)。食管癌組織中MAL mRNA表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁食管黏膜組織，差異有顯著性(χ2=30.59,P<0.01)。見(jiàn)圖1。

　　圖1 RT-PCR檢測(cè)食管癌組織MAL mRNA的表達(dá)

　?、?、②為食管癌組織MAL mRNA表達(dá)陽(yáng)性;③、④為食管癌組織MAL mRNA表達(dá)陰性;⑤為X174/HaeⅢ分子質(zhì)量標(biāo)志物

　　2.2 MAL mRNA的半定量RT-PCR檢測(cè)

　　2.2.1 食管癌組織和癌旁組織中MAL mRNA表達(dá)水平比較 本文45例食管癌組織MAL mRNA相對(duì)表達(dá)水平為0.90±0.11，而癌旁組織中MAL mRNA的表達(dá)水平為1.51±0.27，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.329，P<0.05)。

　　2.2.2 食管癌組織MAL mRNA表達(dá)水平與臨床病理分期的關(guān)系 MAL mRNA表達(dá)水平與食管癌病人性別、年齡無(wú)關(guān)，但隨臨床分期的增高，其表達(dá)水平明顯降低(P<0.001)，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者M(jìn)AL mRNA表達(dá)水平顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者(P<0.001)。見(jiàn)表1。表1 食管癌組織MAL mRNA表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

　　3 討 論

　　MAL基因定位于2q13，共含有4個(gè)外顯子,其cDNA長(zhǎng)為1 051 bp。MAL是T淋巴細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白，它強(qiáng)烈表達(dá)于正常食管上皮細(xì)胞，1987年ALONSO等[1]報(bào)道具有特征性的MAL cDNA克隆呈現(xiàn)在成熟T淋巴細(xì)胞上。現(xiàn)已證實(shí)，MAL是組成向頂端運(yùn)輸?shù)募?xì)胞膜和分泌性蛋白的必不可少的組成部分[2~6]?；贛AL的功能是誘發(fā)廣泛的大量囊泡形成，有作者提出,MAL在頂端傳送體的形成中扮演著重要角色[7,8]。現(xiàn)在已有許多研究證明，MAL表達(dá)和人類食管惡性腫瘤相關(guān)。有學(xué)者報(bào)道，MAL基因在食管癌發(fā)生的不同階段均表達(dá)下調(diào)，且從不同角度分析和探討MAL基因表達(dá)下調(diào)的可能機(jī)制，MAL的不表達(dá)或表達(dá)下調(diào)在食管癌發(fā)生中可能起決定性作用[9,10]。

　　TUGORES等[11]報(bào)道，MAL啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)缺失影響轉(zhuǎn)錄子失活，沒(méi)有觀察到MAL基因組區(qū)有遺傳性的修改，而且在13例食管癌細(xì)胞株中有3例MAL啟動(dòng)子發(fā)生甲基化，9例細(xì)胞株中MAL表達(dá)正調(diào)節(jié)。其機(jī)制可能為MAL啟動(dòng)子DNA甲基化和組蛋白脫乙?；鶇f(xié)同作用于MAL基因?qū)е履[瘤發(fā)生。然而，現(xiàn)在仍沒(méi)有明確MAL基因在癌組織中表達(dá)是否被其他機(jī)制調(diào)節(jié)，如染色體缺失、突變或其他畸變。功能性測(cè)定表明，在癌細(xì)胞中外源性MAL的表達(dá)可引起細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性降低，在活體內(nèi)致瘤性下降。本研究采用定性和半定量?jī)煞N方法研究了食管癌MAL mRNA的表達(dá)與性別、年齡、臨床分期及組織學(xué)分級(jí)等因素的關(guān)系。結(jié)果顯示，MAL mRNA的表達(dá)缺失在不同性別、年齡中無(wú)明顯差異，從而推測(cè)食管癌MAL mRNA的表達(dá)缺失與性別、年齡無(wú)關(guān)，而MAL基因的表達(dá)與食管癌的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期也無(wú)相關(guān)性，與文獻(xiàn)[12,13]報(bào)道不符，可能與病例數(shù)較少有關(guān)。本文研究結(jié)果顯示，食管癌組織 MAL mRNA相對(duì)表達(dá)量與癌旁組織比較差異有顯著性，且隨臨床分期和組織學(xué)分級(jí)的增高，其表達(dá)水平明顯降低，即MAL基因在食管癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)。表明MAL基因表達(dá)下調(diào)是食管癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)頻發(fā)事件。國(guó)內(nèi)許智雄等[14]通過(guò)PCR分析顯示，在食管癌細(xì)胞系EC109、EC8712和EC9706中都存在被分析的MAL基因片段。

　　本文在研究食管癌組織MAL基因的表達(dá)同時(shí)，也探討了MAL基因與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組MAL的表達(dá)顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組(P<0.05)，提示食管癌組織MAL的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著的相關(guān)性，關(guān)于MAL基因如何調(diào)節(jié)食管癌淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不十分清楚。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，MAL的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著的相關(guān)性，因此，MAL基因的表達(dá)與食管癌的預(yù)后有一定的相關(guān)性。目前，關(guān)于食管癌MAL基因與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系的同類研究尚未見(jiàn)報(bào)道，要得到更加準(zhǔn)確和客觀的結(jié)果還需要更大樣本量的研究。