MAL基因在原發(fā)食管癌組織表達及臨床意義

 
　　作者：陳皓　　作者單位：泰安市中心醫(yī)院腫瘤外科，山東 泰安 271000


　　THE ex[x]pression AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF MAL GENE IN PRIMARY ESOPHAGUS CANCER CHEN HAO (Department of Oncology, Taian Central Hospital, Taian 271000, China)

　　[ABSTRACT] ob[x]jective To explore the relevance between MAL gene ex[x]pression, clinical stage and histologic grade of esophagus cancer. Methods The MAL gene ex[x]pression in 45 cancer patients was detected with RT-PCR and semi-quantitative RT-PCR technique. Results The mRNA ex[x]pression of MAL in 40 cancer tissue samples was lower than that in the surrounding esophagus mucous membrane (χ2=30.59,P<0.01). The gene ex[x]pression in stages Ⅰ and Ⅱ patients was higher than that in stage Ⅲ patients (t=5.952,P<0.001). Those with lymph node me[x]tastasis showed lower gene ex[x]pression than patients without (t=6.743,P<0.001). Conclusion In esophagus cancer, the MAL gene ex[x]pression was associated with histologic grade and clinical stage, which can be used for determining tumor malignancy and predicting its prognosis.

　　[KEY WORDS] Esophageal neoplasms; MAL gene; Reverse transc[x]riptase polymerase chain reaction

　　MAL基因是由ALONSO等[1]于1987年分離得到的抑制腫瘤生長的新基因，MAL基因失活及異常與細胞信號轉導、腫瘤的發(fā)生發(fā)展和臨床預后等有一定關系。近年來，MAL基因與食管癌的關系已成為研究的熱點。本研究利用定性和半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測食管癌組織及其癌旁組織中MAL基因的表達情況，旨在探討MAL基因在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，及其與臨床病理因素的關系，為食管癌發(fā)病機制的研究提供新思路。

　　1 材料與方法

　　1.1 標本來源

　　1.1.1 病例選擇 2004年6月~2006年3月，泰安市中心醫(yī)院住院的食管癌病人45例，男25例，女20例;年齡36～79歲，平均57.5歲。術前均未發(fā)現(xiàn)遠處轉移，未行放、化療治療。手術方式均為經左胸行食管癌次全切除胃-食管弓上或弓下吻合術，術中無肉眼可見腫瘤殘留。術后病理檢查均證實為鱗癌。按UICC食管癌分期標準(1997)進行分期。

　　1.1.2 標本取材和保存 食管癌組織及癌旁組織取自食管癌病人手術標本，組織離體后立即無菌取材，從腫瘤生長活躍無壞死的部位取下約1 cm3癌組織及5 cm外癌旁組織，標本30 min內送實驗室，新鮮提取總RNA;不能保證30 min內制備樣品的，在取材后放-80 ℃冰箱保存?zhèn)錅y。

　　1.2 檢測方法

　　采用半定量RT-PCR法檢測MAL mRNA的相對表達水平。①總RNA提?。翰捎肨rizol提取總RNA，并進行純度和濃度測定。②RT反應:于DEPC處理的Eppendorf管中，加入1 μg總RNA、MMLV及隨機引物等，快速離心混勻后，37 ℃ 1 h，95 ℃ 10 min滅活MMLV，快速離心使蒸氣沉于管底。③PCR反應：于0.5 mL Eppendorf管中加入RT反應產物、PCR反應體系、MAL上游引物(5′-AAGATCCTCTGCTGACCCCT-3′)、MAL下游引物(5′-ACCATGGACCTCTGGAAAGA-3′)、β-actin上游引物(5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′)，以及β-actin下游引物(5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′)，擴增片段長度為500 bp;95 ℃ 5 min，離心使蒸氣沉于管底，加Taq DNA聚合酶，快速離心混勻。循環(huán)條件：94 ℃ 1 min，58 ℃1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次，末次延伸7 min。電泳鑒定，觀察目的基因，實驗中僅出現(xiàn)一條500 bp β-actin條帶為MAL mRNA陰性;同時出現(xiàn)166 bp條帶為MAL mRNA陽性。采用數字圖像分析儀2200系統(tǒng)觀察拍照并進行半定量分析，以MAL/β-actin比值作為MAL mRNA相對表達量，若比值小于25%為表達缺失，若比值小于50%則為低表達，低表達與表達缺失均為異常表達。

　　1.3 統(tǒng)計學分析

　　應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，對定性RT-PCR結果進行χ2檢驗及確切概率法;對半定量RT-PCR結果進行t檢驗。

　　2 結 果

　　2.1 食管癌組織和癌旁組織中MAL mRNA的定性檢查結果比較

　　45例食管癌組織中未見MAL表達者28例，弱表達者12例;癌旁組織食管黏膜組織MAL mRNA全部呈陽性表達。食管癌組織中MAL mRNA表達明顯低于相應的癌旁食管黏膜組織，差異有顯著性(χ2=30.59,P<0.01)。見圖1。

　　圖1 RT-PCR檢測食管癌組織MAL mRNA的表達

　?、?、②為食管癌組織MAL mRNA表達陽性;③、④為食管癌組織MAL mRNA表達陰性;⑤為X174/HaeⅢ分子質量標志物

　　2.2 MAL mRNA的半定量RT-PCR檢測

　　2.2.1 食管癌組織和癌旁組織中MAL mRNA表達水平比較 本文45例食管癌組織MAL mRNA相對表達水平為0.90±0.11，而癌旁組織中MAL mRNA的表達水平為1.51±0.27，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(t=2.329，P<0.05)。

　　2.2.2 食管癌組織MAL mRNA表達水平與臨床病理分期的關系 MAL mRNA表達水平與食管癌病人性別、年齡無關，但隨臨床分期的增高，其表達水平明顯降低(P<0.001)，且淋巴結轉移陽性者MAL mRNA表達水平顯著低于淋巴結轉移陰性者(P<0.001)。見表1。表1 食管癌組織MAL mRNA表達水平與臨床病理特征的關系

　　3 討 論

　　MAL基因定位于2q13，共含有4個外顯子,其cDNA長為1 051 bp。MAL是T淋巴細胞成熟相關蛋白，它強烈表達于正常食管上皮細胞，1987年ALONSO等[1]報道具有特征性的MAL cDNA克隆呈現(xiàn)在成熟T淋巴細胞上。現(xiàn)已證實，MAL是組成向頂端運輸的細胞膜和分泌性蛋白的必不可少的組成部分[2~6]?；贛AL的功能是誘發(fā)廣泛的大量囊泡形成，有作者提出,MAL在頂端傳送體的形成中扮演著重要角色[7,8]?，F(xiàn)在已有許多研究證明，MAL表達和人類食管惡性腫瘤相關。有學者報道，MAL基因在食管癌發(fā)生的不同階段均表達下調，且從不同角度分析和探討MAL基因表達下調的可能機制，MAL的不表達或表達下調在食管癌發(fā)生中可能起決定性作用[9,10]。

　　TUGORES等[11]報道，MAL啟動子區(qū)設計缺失影響轉錄子失活，沒有觀察到MAL基因組區(qū)有遺傳性的修改，而且在13例食管癌細胞株中有3例MAL啟動子發(fā)生甲基化，9例細胞株中MAL表達正調節(jié)。其機制可能為MAL啟動子DNA甲基化和組蛋白脫乙酰基協(xié)同作用于MAL基因導致腫瘤發(fā)生。然而，現(xiàn)在仍沒有明確MAL基因在癌組織中表達是否被其他機制調節(jié)，如染色體缺失、突變或其他畸變。功能性測定表明，在癌細胞中外源性MAL的表達可引起細胞運動性降低，在活體內致瘤性下降。本研究采用定性和半定量兩種方法研究了食管癌MAL mRNA的表達與性別、年齡、臨床分期及組織學分級等因素的關系。結果顯示，MAL mRNA的表達缺失在不同性別、年齡中無明顯差異，從而推測食管癌MAL mRNA的表達缺失與性別、年齡無關，而MAL基因的表達與食管癌的組織學分級、臨床分期也無相關性，與文獻[12,13]報道不符，可能與病例數較少有關。本文研究結果顯示，食管癌組織 MAL mRNA相對表達量與癌旁組織比較差異有顯著性，且隨臨床分期和組織學分級的增高，其表達水平明顯降低，即MAL基因在食管癌組織中表達顯著下調。表明MAL基因表達下調是食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的一個頻發(fā)事件。國內許智雄等[14]通過PCR分析顯示，在食管癌細胞系EC109、EC8712和EC9706中都存在被分析的MAL基因片段。

　　本文在研究食管癌組織MAL基因的表達同時，也探討了MAL基因與食管癌淋巴結轉移的關系。結果顯示，淋巴結轉移陽性組MAL的表達顯著低于淋巴結轉移陰性組(P<0.05)，提示食管癌組織MAL的低表達與淋巴結轉移存在顯著的相關性，關于MAL基因如何調節(jié)食管癌淋巴轉移的機制仍不十分清楚。淋巴結轉移是食管癌的獨立危險因素，MAL的低表達與淋巴結轉移存在顯著的相關性，因此，MAL基因的表達與食管癌的預后有一定的相關性。目前，關于食管癌MAL基因與淋巴結轉移的關系的同類研究尚未見報道，要得到更加準確和客觀的結果還需要更大樣本量的研究。