簇蛋白在前列腺上皮細(xì)胞凋亡中的表達(dá)和作用

作者：王旭亮　　作者單位：杭州市人民醫(yī)院泌尿外科，杭州 310006

　　【關(guān)鍵詞】 簇蛋白;轉(zhuǎn)化生長因子β1;凋亡

　　簇蛋白(clusterin)早于1983年由Blaschuk等在鼠睪丸液中分離出來[1]。1987年，Leger等[2]在去勢(shì)后的前列腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種凋亡相關(guān)基因TRPM2(testosteronerepressed prostate message2)。隨后，實(shí)驗(yàn)證明了TRPM2所表達(dá)的蛋白就是clusterin[3]。但目前對(duì)于clusterin在前列腺細(xì)胞凋亡過程中的作用認(rèn)識(shí)尚未清楚。本文觀察clusterin在前列腺上皮細(xì)胞凋亡過程中的表達(dá)情況和部位，初步探討clusterin的作用及與TGFβ1的關(guān)系。

　　1 材料與方法

　　1.1 標(biāo)本來源 10只成年家犬(2-6歲)，購自天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。將犬隨機(jī)編號(hào)，按編號(hào)順序分別于去勢(shì)前及去勢(shì)后15d內(nèi)、15d后經(jīng)腹腔行前列腺活檢術(shù)。前列腺組織在10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液中固定后，以石蠟包埋組織備用。

　　1.2 主要試劑 一抗：clusterin(H330)兔抗人多克隆抗體和TGFβ1(sc146)兔抗人多克隆抗體均購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司;二抗：生物素化山羊抗兔IgG和三抗：辣根素標(biāo)記鏈親和素均購于中山公司。

　　1.3 免疫組織化學(xué)方法(ABC法) 用ReichertJung(德國)切片機(jī)切片，厚度為5μm。然后烤片后置于二甲苯中脫蠟，梯度乙醇至水，3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2封閉組織生物酶?？乖迯?fù)后正常羊血清封閉10min，加clusterin一抗(稀釋度1∶75)37℃孵育2h，二抗37℃孵育0.5h，三抗37℃孵育20min。各步驟間PBS漂洗，后DAB顯色。TGFβ1免疫組化同clusterin步驟。PBS代替clusterin和TGFβ1的一抗,作為陰性對(duì)照。

　　1.4 結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) 光學(xué)顯微鏡下(×400倍)計(jì)數(shù)每平方毫米的染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。依染色細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)，將結(jié)果分為五個(gè)級(jí)別：-，+，，，。其中，-為陽性細(xì)胞數(shù)≤5%;+為≤10%;為≤20%;為≤40%;為>40%。

　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用數(shù)據(jù)加權(quán)后秩和檢驗(yàn)，分別對(duì)clusterin及TGFβ1的表達(dá)進(jìn)行分析，P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在差異。對(duì)于clusterin與TGFβ1的關(guān)系，應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 簇蛋白在前列腺組織中的表達(dá)情況 clusterin在前列腺去勢(shì)前幾乎不表達(dá)，在去勢(shì)后近期(<15d)表明明顯增加，于去勢(shì)后遠(yuǎn)期(>15d)又恢復(fù)至去勢(shì)前水平。去勢(shì)前與去勢(shì)后近期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，而與去勢(shì)后遠(yuǎn)期無差異(P>0.05)，去勢(shì)后近期與遠(yuǎn)期差異具有顯著性(P<0.01)。clusterin主要在去勢(shì)后發(fā)生凋亡比較活躍的前列腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，而前列腺基質(zhì)細(xì)胞中僅有個(gè)別細(xì)胞表達(dá)。 Clusterin在前列腺組織中的表達(dá)

　　2.2 TGFβ1在前列腺組織中的表達(dá)情況 TGFβ1的表達(dá)在去勢(shì)前與去勢(shì)后近期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，而與去勢(shì)后遠(yuǎn)期無差異(P>0.05)，去勢(shì)后近期與遠(yuǎn)期差異具有顯著性(P<0.01)。TGFβ1在前列腺組織中的表達(dá)

　　2.3 clusterin與TGFβ1的相關(guān)性 綜合上面兩表運(yùn)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，clusterin和TGFβ1相關(guān)系數(shù)為0.706，P<0.01，存在相關(guān)性。

　　3 討 論

　　關(guān)于clusterin在前列腺細(xì)胞凋亡過程中的作用，有學(xué)者認(rèn)為clusterin阻止了細(xì)胞周期進(jìn)展而促使細(xì)胞凋亡加速[4]，另外的觀點(diǎn)認(rèn)為clusterin在細(xì)胞內(nèi)的堆積導(dǎo)致了細(xì)胞增生的減慢和誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡[5]。雖然clusterin 的功能目前還不完全了解，但是無疑它的表達(dá)和前列腺細(xì)胞的凋亡有密切的關(guān)系。

　　我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，clusterin在前列腺去勢(shì)前幾乎不表達(dá)，在前列腺去勢(shì)后近期(<15d)，clusterin表達(dá)開始明顯增加，達(dá)到高峰后在去勢(shì)后遠(yuǎn)期(>15d)又恢復(fù)去勢(shì)前的水平;clusterin基本表達(dá)在去勢(shì)后發(fā)生凋亡比較活躍的前列腺上皮細(xì)胞中，而前列腺基質(zhì)細(xì)胞中只有個(gè)別的細(xì)胞表達(dá)。這些結(jié)果表明：①clusterin的表達(dá)與前列腺的腺上皮細(xì)胞的凋亡有關(guān);②去勢(shì)后前列腺基質(zhì)的退縮與clusterin的表達(dá)無關(guān);③動(dòng)態(tài)的來看，表達(dá)clusterin的細(xì)胞都多數(shù)是即將發(fā)生凋亡的細(xì)胞。

　　研究表明，clusterin作為一種外分泌蛋白，表現(xiàn)為一種膜穩(wěn)定的作用，它的受體為細(xì)胞表面的gp330/megalin受體[6]。眾所周知，細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)的有序的需氧需能過程，而這個(gè)過程需要維持細(xì)胞膜和線粒體膜的完整性。而clusterin可能在維持這種膜穩(wěn)定過程中起到重要的作用。因此假設(shè)，clusterin在和細(xì)胞表面受體結(jié)合以后，表現(xiàn)為一種細(xì)胞的膜穩(wěn)定作用，但是這種作用不能阻止細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶的作用。在凋亡病變時(shí)，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為膜的損害輕而細(xì)胞核的損害重。clusterin的表達(dá)可能與凋亡過程中細(xì)胞膜病變輕有關(guān)。

　　因此，我們認(rèn)為clusterin是前列腺上皮細(xì)胞凋亡病變過程中的一個(gè)效應(yīng)分子，它在前列腺凋亡中沒有實(shí)質(zhì)性的功能。在細(xì)胞的凋亡早期，染色體尚未被破壞，凋亡細(xì)胞表達(dá)一系列的蛋白質(zhì)包括clusterin。Clusterin的存在使凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜保持了完整，保證了凋亡過程繼續(xù)進(jìn)行。至染色體被內(nèi)源性的核酸內(nèi)切酶切斷后，凋亡的過程已經(jīng)不可逆，同時(shí)染色體的切斷使clusterin的表達(dá)終止。

　　在研究中，前列腺上皮組織中表達(dá)clusterin的上皮細(xì)胞基本上都有TGFβ1的表達(dá)，且集中在凋亡活躍的分泌上皮的區(qū)域內(nèi)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)了上述兩種因子的表達(dá)存在一定的相關(guān)性。這說明TGFβ1 和clusterin是存在著一定的相互因果關(guān)系。有研究證實(shí)clusterin的表達(dá)受TGFβ的調(diào)控，而這種調(diào)控為涉及多個(gè)因子的復(fù)雜的過程 [7]。

　　綜上所述，clusterin作為前列腺細(xì)胞調(diào)亡過程中的一個(gè)效應(yīng)分子，受TGFβ表達(dá)的調(diào)控。