TL1A抗體通過(guò)抑制活性氧產(chǎn)生阻止高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

作者：陳豐華,馮大明　　作者單位：南華大學(xué)心血管病研究所，動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

　　【摘要】 目的：探討TL1A抗體在高糖所致活性氧(ROS)增多及細(xì)胞凋亡中的作用。方法：將培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為正常對(duì)照組、正常糖+TL1A組、高糖對(duì)照組、高糖+SOD+CAT組、高糖+TL1A抗體組和高滲對(duì)照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成量; Annexin V/PI熒光雙染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，高糖對(duì)照組ROS生成量增加53%，細(xì)胞凋亡率達(dá)正常的5.8倍(P<0.01)。于正常糖培養(yǎng)液中加入外源性TL1A蛋白，活性氧的生成量及細(xì)胞凋亡率均明顯增多，顯著高于正常對(duì)照組和高糖對(duì)照組(P<0.01);在高糖培養(yǎng)液中加入9 μg/ml TL1A抗體，活性氧生成量由(71.63±6.61)降至(50.63±4.05)，細(xì)胞凋亡率由(23.70±3.20)% 降至(5.07±0.47)%(P<0.01)。結(jié)論：TL1A抗體通過(guò)抑制ROS產(chǎn)生阻止高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

　　【關(guān)鍵詞】 糖尿病,高糖,腫瘤壞死因子樣配體1A抗體,活性氧;內(nèi)皮細(xì)胞;凋亡

　　Abstract：ob[x]jectiveTo investigate the role of anti-TL1A-Ab in the prevention of high glucose-induced ROS generation and apoptosis in human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).MethodHUVEC were divided into six groups：normal control group，5.6 mM glucose plus TL1A group，high glucose control group，high glucose plus SOD plus CAT group，high glucose plus anti-TL1A-Ab group and high osmotic control group.ROS generation was determined by flow cytometry，apoptosis rate of HUVEC was determined by flow cytometry with Annexin V/PI double staining.ResultsExposure of HUVEC to 22.4 mM glocose for 24 h resulted in a significant increase in ROS generation and apoptosis，compared with normal control group(P<0.01).HUVEC ROS formation and apoptosis rate significantly increased after adding exogenous TL1A to media containing 5.6 mM of glucose for 24 h，compared with normal control group and high glucose control group(P<0.01).However，high glucose-induced HUVEC ROS generation and apoptosis was significantly attenuated by 9 μg/ml anti-TL1A-Ab 〔(50.63±4.05) vs (71.63±6.61)，(5.07±0.47)% vs (23.70±3.20)%,P<0.01〕.ConclusionAnti-TL1A-Ab preventets high glucose-induced HUVEC apoptosis through ROS inhibition.

　　Key Words:Diabetes;High glucose;Anti-TNF-like ligand 1 aberrance antibody;Reactive oxygen species;Endothelia cells;Apoptosis

　　糖尿病是當(dāng)今嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病，血管病變是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)主要并發(fā)癥之一，其形成的確切機(jī)理尚不明了。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損被認(rèn)為是血管病變的首要步驟，體外及在體研究都證明，高糖可抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，延長(zhǎng)細(xì)胞周期，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是內(nèi)皮受損的一種常見(jiàn)形式，阻止高糖觸發(fā)的細(xì)胞凋亡，可能是DM血管并發(fā)癥的有效防治途徑。高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未闡明。普遍認(rèn)為，高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與活性氧(Reactive oxygen species，ROS)生成過(guò)量、清除減少，導(dǎo)致氧化應(yīng)激(Oxidative stress)有關(guān)[1]。TL1A作為一種新近發(fā)現(xiàn)的能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子，是否參與了DM血管病變的發(fā)生發(fā)展，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。我們近的工作得出在高糖條件下，TL1A表達(dá)明顯增多。TL1A是否通過(guò)ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡尚未見(jiàn)報(bào)道。本文探討TL1A抗體在高糖所致血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS增多及凋亡中的作用。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料和主要試劑：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-12細(xì)胞，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心提供)，TL1A蛋白和抗TL1A抗體(Biolegend公司)，Annexin V FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，活性氧檢測(cè)試劑(北京 SINOPCR有限公司)。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(5.6 mM葡萄糖)，正常糖+TL1A組(5.6 mM葡萄糖培養(yǎng)液中加入外源性TL1A蛋白50 ng/L處理24 h)，高糖對(duì)照組(22.4 mM葡萄糖)，高糖+SOD+CAT組(22.4 mM葡萄糖培養(yǎng)液中加入超氧化物歧化酶200 U/ml，過(guò)氧化氫酶100 U/ml)，高糖+TL1A抗體組(22.4 mM葡萄糖培養(yǎng)液中加入9 μg/ml TL1A抗體)，高滲對(duì)照組(5.6 mM葡萄糖+16.8 mM甘露醇)。

　　1.3 活性氧含量的測(cè)定：細(xì)胞收集后經(jīng)0.25%胰酶消化、洗滌，重懸于PBS中,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至4 ×105/ml。加入DCFH-DA (無(wú)水乙醇配制)1 μl，避光，37 ℃水浴30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)光488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)525 nm) 。

　　1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用Annexin V/PI熒光雙染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率。用不含EDTA的胰酶消化收集1～5×105個(gè)細(xì)胞，Binding Buffer懸浮后加入5 μl Annexin V-FITC混勻，加入5 μl Propidium Iodide，混勻;室溫、避光，反應(yīng)5～15 min，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)530 nm。Cell Quest軟件自動(dòng)獲取104個(gè)細(xì)胞/樣品，流式細(xì)胞儀定量分析，計(jì)算annexin V-FITC及PI雙染陽(yáng)性細(xì)胞百分含量。

　　2 結(jié)果

　　2.1 TL1A抗體對(duì)高糖條件下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成的影響：正常對(duì)照組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成量為(46.80±4.10)，高糖對(duì)照組細(xì)胞活性氧生成量顯著增高，為(71.63±6.61)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在正常糖培養(yǎng)液中加入50 ng/ml TL1A蛋白，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成量升高至(93.75±9.12)，達(dá)正常對(duì)照組的2倍，二者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，也顯著高于高糖對(duì)照組(P<0.01)。高糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液加入9 μg/ml TL1A抗體，活性氧的生成量由(71.63±6.61)降至(50.63±4.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與高糖培養(yǎng)液中加入SOD和CAT組(53.32±5.41)相比略低，而與正常對(duì)照組相比有輕微增多，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2.2 TL1A抗體對(duì)高糖所致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。正常對(duì)照組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率為(4.09±0.39)%，高糖對(duì)照組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率為(23.70±3.20)%，約為正常對(duì)照組的5.8倍，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。于高糖培養(yǎng)液中加入SOD和CAT，細(xì)胞凋亡率顯著降低，為(5.41±0.55)%，與高糖對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而于高糖培養(yǎng)液中加入TL1A抗體，細(xì)胞凋亡率降至(5.07±0.47)%，顯著低于高糖對(duì)照組(P<0.01)，略低于高糖+SOD+CAT組，與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。正常糖培養(yǎng)液中加入TL1A蛋白，則細(xì)胞凋亡率達(dá)正常對(duì)照組8.6倍，達(dá)高糖對(duì)照組1.5倍(P<0.01)，高滲透壓不引起細(xì)胞凋亡。

　　3 討論

　　糖尿病血管病變是心、腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，也是人類致死、致殘的重要原因，血管病變形成的機(jī)制尚不清楚。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是血管病變的首要步驟，有研究表明，高血糖能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制尚未闡明。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是高血糖導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制。在我們的實(shí)驗(yàn)中，高糖使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成增加53%，而在正常糖培養(yǎng)的HUVEC中加入TL1A，ROS的生成量增加1倍，為(93.75±9.12)，不僅顯著高于正常對(duì)照組，也顯著高于高糖對(duì)照組的(71.63±6.61)。在高糖培養(yǎng)的HUVEC中加入TL1A抗體，活性氧的生成量顯著減少，為(50.63±4.05)，明顯低于高糖對(duì)照組的(71.63±6.61)，P<0.01，也略低于高糖加ROS清除系統(tǒng)組，與正常對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明TL1A抗體能顯著抑制高糖所致血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成增多。

　　TL1A抗體抑制ROS生成的機(jī)制尚不清楚。氧化還原反應(yīng)是細(xì)胞基本的生物化學(xué)反應(yīng)，是細(xì)胞功能活動(dòng)的基礎(chǔ)，也是容易遭受損傷的環(huán)節(jié)。各種病理因素都有可能破壞細(xì)胞氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致ROS生成增多，清除減少。高糖條件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成過(guò)多，主要來(lái)源被認(rèn)為是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶和線粒體[2]。ROS增多引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致多元醇通路激活、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)形成、蛋白激酶C(PKC)途徑及氨基己糖途徑活化，而上述通路的激活及AGEs 形成又可進(jìn)一步激活NADPH氧化酶，促進(jìn)更多的ROS形成[3]。 TL1A抗體是否通過(guò)抑制NADPH氧化酶和作用于線粒體減少ROS生成，有待闡明。

　　TL1A是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的負(fù)調(diào)控因子，其基本作用是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。在我們的試驗(yàn)中，高糖使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡顯著增多，其細(xì)胞凋亡百分率約為正常對(duì)照組的5.8倍，于正常糖培養(yǎng)液中加入外源性TL1A，細(xì)胞凋亡率達(dá)正常對(duì)照組的8.6倍，達(dá)高糖組的1.5倍。在高糖培養(yǎng)液中加入9 μg/ml TL1A抗體，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率由(23.70±3.20)% 降至(5.07±0.47)%(P<0.01)，與高糖+SOD+CAT組相比略低，與正常對(duì)照組相比有輕微增高，但二者相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合前述結(jié)果，說(shuō)明TL1A抗體能通過(guò)抑制活性氧生成而阻止高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

　　TL1A抗體抑制ROS生成增多導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，國(guó)外極少資料報(bào)道，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。ROS可激活細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)和酶，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子如NF-kB和激活蛋白-1(AP-1)表達(dá)上調(diào)，這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)著編碼多種炎性介質(zhì)的基因，從而導(dǎo)致與血管細(xì)胞生理及病理功能密切相關(guān)的眾多基因的表達(dá)。進(jìn)一步的分析研究認(rèn)為，高糖誘導(dǎo)組織損傷的共同要素是三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3- phosphate，GAPDH)受抑制[4]。ROS造成細(xì)胞核DNA鏈斷裂，DNA損傷片段特異性激活多聚-ADP-核糖-聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)，活化的PARP 修飾GAPDH，使GAPDH分子的ADP核糖多聚化，導(dǎo)致其活性被抑制[5]。ROS作為極其重要的細(xì)胞內(nèi)信使，通過(guò)抑制GAPDH活性幾乎可激活所有已知的與糖尿病微血管及大血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，包括PKC通路、多元醇通路、己糖胺通路以及AGEs形成等。PARP的活化和GAPDH活性受抑制，造成糖酵解和線粒體的呼吸速率減慢，電子傳遞受阻、ATP缺乏，內(nèi)皮功能紊亂甚至凋亡，并終導(dǎo)致DM血管病變形成[6]。探索用TL1A抗體或具有相似作用的藥物對(duì)DM血管病變進(jìn)行早期干預(yù)，減少ROS形成，阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，有可能預(yù)防或延緩DM血管病變發(fā)生發(fā)展，成為DM血管病變防治中的一個(gè)有效途徑。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1] Nishikawa T，Edelstein D，Du XL，et al.Normalizing mito-chondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage[J].Nature，2000，404(6779)：7871.

　　[2] Guzik TJ，Mussa S，Gastaldi D，et al.Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus：role of NAD(P) H oxidase and endothelial nitric oxide synthase[J].Circulation，2002，105(14)：1656.

　　[3] Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J].Nature，2001，414(6865)：8131.

　　[4] Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications：a unifying mechanism[J].Diabetes，2005，54(6)：1615.

　　[5] Garcia Soriano F，Virag L，Jagtap P，et al.Diabetic endothelial dysfunction：the role of poly (ADP-ribose ) polymerase activation[J].Nat Med，2001，7(1):108.

　　[6] Pacher P，Liaudet L，Garcia Soriano FG，et al.The role of poly ( ADP-ribose ) polymerase- activation in the development of myocardial and endothelial dysfunction in diabetes[J]. Diabetes，2002，51(2)：514.