伊貝沙坦對糖尿病大鼠心臟的保護(hù)作用及抗氧化反應(yīng)的機(jī)制探討

【摘要】  　　【目的】 探討血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑伊貝沙坦對糖尿病大鼠心臟的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制?！痉椒ā?將30只Wistar 大鼠隨機(jī)分為正常對照組、糖尿病組和伊貝沙坦組3組，每組10只。造模后12周終止實(shí)驗(yàn)處死大鼠，取血、尿和心臟標(biāo)本，測定尿量、體質(zhì)量、心臟質(zhì)量/體質(zhì)量、血糖、糖化血紅蛋白（HbA1c）；測定血液和心臟組織的丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性；通過電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的變化。【結(jié)果】 12周終止實(shí)驗(yàn)時糖尿病各組大鼠的尿量、心臟質(zhì)量/體質(zhì)量、血糖、HbA1c、血清和心臟組織的MDA水平均明顯高于正常組，而體質(zhì)量、紅細(xì)胞和心臟組織的SOD活性明顯低于正常組（P< 0.05）；伊貝沙坦組大鼠的血清和心臟組織的MDA水平明顯低于糖尿病組，而SOD的活性高于糖尿病組（P< 0.05）。糖尿病組大鼠的心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯損傷，伊貝沙坦組大鼠的心臟組織超微結(jié)構(gòu)損傷較輕?！窘Y(jié)論】 伊貝沙坦能減輕糖尿病大鼠心臟損害的進(jìn)展，其機(jī)制可能與伊貝沙坦抑制糖尿病大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和提高抗氧化能力有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】  糖尿??； 大鼠； 伊貝沙坦； 丙二醛； 超氧化物歧化酶； 心??； 超微結(jié)構(gòu)

    Abstract: 【ob[x]jective】 To investigate the protective effects of irbesartan on myocardium and its anti-oxidative stress mechanism in diabetic rats. 【Methods】 Thirty male Wistar rats were randomly divided into three groups: control group(n=10), diabetic group(n=10), irbesartan group(n=10). At the end of 12 weeks, the rats were killed. Urine volume, body mass, heart mass/body weight, plasma glucose, glycosylated hemoglobin (HbA1c) were measured. Malondialdehyde (MDA) levels and superoxide dismutase (SOD) activity in serum or red blood cells and heart tissues were tested.  Myocardium was taken for electromicroscopy.【Results】 Urine volume, heart mass/body mass, plasma glucose, HbA1C, MDA levels of blood and heart tissue in diabetic rats were significantly greater than those of normal controls (P< 0.05). But body weight, SOD activity of blood and heart tissue in control group were higher than that of diabetic and irbesartan group. After 8 weeks of treatment, SOD activity of red blood cells and heart tissue in rats of irbesartan group were significantly higher than those of diabetic rats (P< 0.05). The injuries of the myocardium including sarcomeres, mitochondria and microvascular endothelial cells were less in irbesartan group than that in diabetic group. 【Conclusion】 Irbesartan could decrease the heart injury in diabetic rats. And the mechanisms might be that irbesartan can reduce the MDA levels and improve SOD activity in STZ-induced diabetic rats.

    Key words: diabetes mellitus; rat; irbesartan; malondialdehyde; superoxide dismutase; myocardium; ultrastructure

    糖尿病心肌病是糖尿病臨床常見并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病患者心力衰竭的主要原因，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。氧化應(yīng)激反應(yīng)在糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，高糖可促進(jìn)線粒體電子傳遞鏈生成的活性氧（reactive oxygen species, ROS），增加超氧自由基的生成，高糖還可損傷機(jī)體自身的抗氧化系統(tǒng)[1, 2]。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠，血管緊張素系統(tǒng)和氧化應(yīng)激參與了糖尿病心肌病變的發(fā)病機(jī)制，血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ, ATⅡ）及其1類受體（angiotensinⅡtype 1 receptor, AT1）和腎素明顯增加，使用AT1拮抗劑能抑制AT1和血管緊張素原，從而減少ATⅡ的合成和細(xì)胞的死亡[3，4]。但是有關(guān)AT1拮抗劑伊貝沙坦對糖尿病心肌病變的保護(hù)作用及其抗氧化反應(yīng)尚未見報道，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察伊貝沙坦對糖尿病大鼠心臟的保護(hù)作用并探討其可能的機(jī)制。

    1   材料與方法

    1．1   動物分組

    雄性、健康Wistar大鼠30只、體質(zhì)量180~250 g、隨機(jī)分為3組：① 正常對照組（正常組）、② 糖尿病未治療組（糖尿病組）、③ 糖尿病伊貝沙坦治療組（伊貝沙坦組），每組10只大鼠。所有大鼠均禁食12 h，各糖尿病組大鼠腹腔1次注射20 g/L STZ （Sigma公司） 50 mg/kg（溶于0.1 mol/L，pH 4.5枸櫞酸緩沖液），正常組大鼠注射相當(dāng)劑量的枸櫞酸緩沖液，72 h后測隨機(jī)微量血糖> 16.7 mmol/L（美國強(qiáng)生One TouchⅡ血糖儀），尿糖+++~++++，穩(wěn)定3 d，可確定為糖尿病大鼠。糖尿病模型確立后第2天開始，伊貝沙坦組大鼠予以伊貝沙坦（安博維，杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司提供）15 mg/（kg·d） 劑量，經(jīng)胃管灌服。正常組和糖尿病組僅給予等量蒸餾水灌胃。整個病程中糖尿病大鼠禁止使用胰島素及任何降糖藥。所有大鼠分籠用本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供的標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，充分供給食、水。病程中每周測1次尿糖和體質(zhì)量，每月測1次血糖，共觀察12周。

    1.2   觀察指標(biāo)

    12周實(shí)驗(yàn)終止，留取24 h尿液，測尿量、測隨機(jī)微量血糖，然后用30 g/L戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉，剖開胸腹，心內(nèi)采血，取心臟標(biāo)本，測量下列指標(biāo)：① 血糖、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin, GHbA1C）：血糖檢測采用葡萄糖氧化酶方法，GHbA1C采用微柱法檢測。②紅細(xì)胞和心臟組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）的測定[5]：采用鄰苯三酚自氧化法；③血清和心臟組織丙二醛（malondialdehyde, MDA）測定[5]：采用改良八木國夫法測定。④透射電鏡觀察心肌組織的變化。

    1.3   統(tǒng)計學(xué)處理

    計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ｘ±ｓ）表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，如方差不齊，先采用秩和檢驗(yàn)，再行組間Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)多重比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α取0.05，所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件處理。

    2   結(jié)   果

    2.1   大鼠尿量、體質(zhì)量、心臟質(zhì)量/體質(zhì)量、血糖、糖化血紅蛋白的變化

    建模后糖尿病組和治療組均出現(xiàn)明顯的高血糖、多飲、多尿、多食、生長遲緩等臨床表現(xiàn)。12周實(shí)驗(yàn)終止時，糖尿病組和伊貝沙坦組血糖、糖化血紅蛋白、尿量、心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值明顯高于正常組，體質(zhì)量明顯低于正常組（P< 0.05），伊貝沙坦組心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值明顯低于糖尿病組（P< 0.05；表1）。

    2.2   大鼠紅細(xì)胞和心臟組織SOD活性血清和心臟組織MDA水平的變化

    糖尿病各組大鼠紅細(xì)胞和心臟組織的SOD活性均低于正常組（P< 0.05），經(jīng)過治療后，伊貝沙坦治療組的紅細(xì)胞和心臟組織SOD活性高于糖尿病組，但心臟組織SOD活性仍低于正常組(P<0.05)；糖尿病各組大鼠血清和心臟組織的MDA水平均高于正常組（P< 0.05），經(jīng)過治療后，伊貝沙坦治療組的血清和心臟組織MDA水平低于糖尿病組，但高低于正常組(P< 0.05,表2)。

    2.3   大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的變化

    與正常組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)比較，糖尿病組大鼠的心肌細(xì)胞水腫，線粒體體積增大，變圓，嵴排列紊亂甚至斷裂，糖原減少，甚至消失；閏盤結(jié)構(gòu)模糊，提示心肌超微結(jié)構(gòu)明顯損傷。而伊貝沙坦治療組大鼠肌原纖維無明顯腫脹，排列整齊；線粒體無腫脹，膜清晰完整，但部分嵴模糊；糖原減少，但仍可見；閏盤結(jié)構(gòu)清晰，說明心肌損傷較輕(圖1~3)。

    3   討   論

    糖尿病大鼠血糖值的確立標(biāo)準(zhǔn)以來各家報道不一致，多在（11.1～16.5）mmol/L之間。近年來，國內(nèi)外基本傾向于認(rèn)定血糖>16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠空腹或非空腹的成模標(biāo)準(zhǔn)[2]。本實(shí)驗(yàn)中，所有糖尿病大鼠在腹腔注射STZ 50 mg/kg 72 h出現(xiàn)多飲、多尿、多食，尿糖強(qiáng)陽性，隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L。病程中檢測尿糖、血糖，始終在建模時的高水平波動，未見轉(zhuǎn)復(fù)，故本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病模型建立是成功的。

    Segar等[6]發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的胰島素依賴型糖尿?。?型糖尿?。┦笤?周時心肌超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病變，表現(xiàn)為心肌組織間隙擴(kuò)大，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)喪失，線粒體腫脹變性，線粒體脊模糊，心肌細(xì)胞核變性。陳剛等[2]發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型在10周時大鼠心肌出現(xiàn)明顯的病變。本研究觀察12周發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)比較糖尿病組大鼠的心肌超微結(jié)構(gòu)明顯損傷，與文獻(xiàn)報道相似[2，6]，證明了本糖尿病大鼠存在明顯的心肌損傷。而伊貝沙坦治療組大鼠心肌損傷較輕，表明伊貝沙坦可減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌損害。

    與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的自由基主要為ROS，包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫和一氧化氮等。機(jī)體內(nèi)存在兩類自由基防御系統(tǒng):一類是酶促防御系統(tǒng),包括SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等；另一類是非酶促防御系統(tǒng),包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽、α-硫辛酸和褪黑素等。它們對清除自由基、保護(hù)細(xì)胞及機(jī)體起重要作用。正常情況下,自由基反應(yīng)對于機(jī)體防御機(jī)制是必要的,自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡。但在某些病理情況下,體內(nèi)自由基大大增加,同時機(jī)體抗氧化防御能力下降,氧化能力大大超過抗氧化能力而發(fā)生氧化應(yīng)激,從而直接引起生物膜脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性，后導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡、組織損傷和疾病發(fā)生。ROS 還可作為重要的細(xì)胞內(nèi)信使,活化許多信號傳導(dǎo)通路,間接導(dǎo)致組織和細(xì)胞的損傷[7]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，SOD是抗氧化的主要指標(biāo)之一，MDA和SOD是目前的反應(yīng)氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)[7，8]。

    目前關(guān)于氧化應(yīng)激反應(yīng)在糖尿病心肌病的發(fā)病中作用尚不十分清晰，但是有研究發(fā)現(xiàn)高糖可促進(jìn)線粒體電子傳遞鏈生成的電力梯度產(chǎn)生ROS，增加超氧自由基的生成，高糖還可損傷機(jī)體自身的抗氧化系統(tǒng)[1]。陳剛等[2]通過基因芯片也發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激相關(guān)基因和能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平在糖尿病性心肌病時明顯下調(diào)。Singal等[9]的研究發(fā)現(xiàn)STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠表現(xiàn)出抗氧化酶反應(yīng)的降低和心肌脂質(zhì)過氧化的增高，而抗氧化劑Probucol能提高心臟功能。Shen等[10]在糖尿病大鼠心臟過表達(dá)MnSOD基因，發(fā)現(xiàn)心肌SOD活性明顯增加，同時可保護(hù)心臟免受外源性氧化劑的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病各組大鼠紅細(xì)胞和心臟組織的SOD活性均低于正常組，經(jīng)過治療后，伊貝沙坦治療組的紅細(xì)胞和心臟組織SOD活性高于糖尿病組，但仍低于正常組；糖尿病各組大鼠血清和心臟組織的MDA水平均高于正常組，經(jīng)過治療后，伊貝沙坦治療組的血清和心臟組織MDA水平低于糖尿病組，但高低于正常組，結(jié)果提示氧化應(yīng)激參與了糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制，而且伊貝沙坦對心肌的保護(hù)作用與其抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

    Kajstura等[11]證實(shí)STZ糖尿病小鼠心肌存在腎素血管緊張素的激活和細(xì)胞的凋亡，通過轉(zhuǎn)基因過表達(dá)胰島素樣生長因子，進(jìn)而抑制p53的功能，減少ATⅡ產(chǎn)生及AT1的活性，從而減少氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞死亡，延緩糖尿病心肌病的發(fā)展。Privratsky等[4]發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可刺激AT1和還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶的表達(dá)，并抑制鼠心肌的收縮功能；使用AT1拮抗劑L-158,809或NADPH氧化酶抑制劑apocynin在改善心肌收縮功能的同時，降低ROS的產(chǎn)生。結(jié)果說明血管緊張素系統(tǒng)和氧化應(yīng)激參與了糖尿病心肌病變的發(fā)病機(jī)制，而應(yīng)用AT1拮抗劑可減輕ROS的產(chǎn)生，減輕糖尿病心肌的病變。

    本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ-1型受體拮抗劑伊貝沙坦能減輕糖尿病大鼠心臟損害的進(jìn)展，其機(jī)制可能與伊貝沙坦抑制糖尿病大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和提高抗氧化能力有關(guān)。

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