噬菌體輔助進(jìn)化和蛋白工程技術(shù)開發(fā)更高效、更緊湊的先導(dǎo)編輯器

Prime Editing（PE,先導(dǎo)編輯）技術(shù)是近年來基因編輯領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破，它為精基因修飾提供了全新的工具。與傳統(tǒng)的CRISPR-Cas9技術(shù)相比，PE在編輯精度和安全性方面具有優(yōu)勢，有望在基因治療、農(nóng)業(yè)育種和基礎(chǔ)研究等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

PE是一種無需DNA雙鏈斷裂的基因編輯技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)單堿基替換、小片段插入/刪除以及長片段敲入。然而，傳統(tǒng)PE依賴的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）存在兩個(gè)主要問題：（1）尺寸過大：M-MLV RT基因長度約2.2 kb，難以適配AAV等遞送載體。（2）效率瓶頸：不同RT對(duì)復(fù)雜編輯（如長片段或高結(jié)構(gòu)模板）效率差異，限制了其臨床應(yīng)用。為了解決這些問題，研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合噬菌體輔助進(jìn)化和蛋白工程技術(shù)，開發(fā)出新一代先導(dǎo)編輯器。

一、噬菌體輔助進(jìn)化（PE-PACE）

研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)基于T7 RNAP的定向進(jìn)化系統(tǒng)，將RT活性與噬菌體增殖直接關(guān)聯(lián)（圖1）。通過連續(xù)進(jìn)化壓力篩選，獲得了多個(gè)高效RT變體：超小型RT：Ec48 RT（1.2 kb）經(jīng)22倍效率提升，性能媲美全長M-MLV RT。高適應(yīng)性變體：針對(duì)長片段/高結(jié)構(gòu)模板的PE6d，在復(fù)雜編輯中效率超越傳統(tǒng)PE3。

PE是一種無需DNA雙鏈斷裂的基因編輯技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)單堿基替換、小片段插入/刪除以及長片段敲入。然而，傳統(tǒng)PE依賴的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）存在兩個(gè)主要問題：（1）尺寸過大：M-MLV RT基因長度約2.2 kb，難以適配AAV等遞送載體。（2）效率瓶頸：不同RT對(duì)復(fù)雜編輯（如長片段或高結(jié)構(gòu)模板）效率差異，限制了其臨床應(yīng)用。為了解決這些問題，研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合噬菌體輔助進(jìn)化和蛋白工程技術(shù)，開發(fā)出新一代先導(dǎo)編輯器。

二、蛋白工程改造RT酶

基于AlphaFold預(yù)測的RT結(jié)構(gòu)，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)關(guān)鍵底物結(jié)合域進(jìn)行突變，提升了DNA/RNA結(jié)合力與持續(xù)合成能力，使短RT實(shí)現(xiàn)長片段高效插入。

四、應(yīng)用場景

1、點(diǎn)突變&短片段編輯

PE6b與PEmaxΔRNaseH針對(duì)短模板優(yōu)化，編輯/indel比提升2.1倍，適合高精度SNP修復(fù)。研究人員將其應(yīng)用至Tay-Sachs病模型細(xì)胞中，PE6a/b實(shí)現(xiàn)16-53%致病突變修正。

2、長片段敲入

PE6c/d在雙pegRNA介導(dǎo)的twinPE中效率提升1.6倍，支持>100 bp片段的無痕插入，可應(yīng)用于重組酶識(shí)別位點(diǎn)安裝、報(bào)告基因敲入等場景。

四、應(yīng)用場景 這項(xiàng)研究通過噬菌體輔助進(jìn)化和蛋白質(zhì)工程，成功開發(fā)了更緊湊、高效的Prime Editors（PE6），為基因編輯技術(shù)的發(fā)展提供了新的突破。PE6系列Prime Editors在編輯效率、編輯器尺寸和體內(nèi)應(yīng)用方面均表現(xiàn)出優(yōu)勢，為未來基因治療提供了新的可能性。