獻(xiàn)血者隱匿性乙型肝炎病毒感染研究進(jìn)展

         乙型肝炎病毒(hepatit“B訪rus,HBV)感染是危害人類健康的嚴(yán)重問(wèn)題之一,全世界約有3億HBV攜帶者,其中我國(guó)就有1億多感染者[Ⅱ21。近年來(lái),一種潛伏性HBV感染形式(LatentHBVinfection),即隱匿性HBV感染(occulthepatit“Bvirusinfecti°n,OBI)受到高度關(guān)注。⒛08年在意大利Ta°rminta召開的專家會(huì)議上,將OBI定義和基本特征描述為肝組織或血清中HBV表面抗原(HBsAg)檢測(cè)陰性而DNA陽(yáng)性(HBsAg—/DNA+),通常病毒載量低或不可定量[3]。隱匿性HBV感染不僅存在于一般人群,部分可以通過(guò)輸血傳播HBV15、還可能與重癥肝損傷和肝細(xì)胞癌有關(guān)[6:],是對(duì)HBV輸血傳播控制、疫苗免疫預(yù)防和臨床感染診療等一系列防治策略的新挑戰(zhàn)。因此,闡明0BI發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,對(duì)血液安仝篩查、疫苗改進(jìn)、臨床治療具有重大指導(dǎo)意義。隨著病毒核酸檢測(cè)工作引人我國(guó)獻(xiàn)血者病毒感染篩查,檢出了數(shù)量可觀的乙型肝炎表面抗原陰性而DNA陽(yáng)性(HBsAg—/DNA+)的血液,其中除窗口期感染外,大部分被判定為OBI。現(xiàn)結(jié)合自身工作.對(duì)國(guó)內(nèi)外OBI研究的新進(jìn)展做一綜述。 
        1 隱匿性乙型肝炎病毒感染研究重點(diǎn)與方向

        自2004年起,英國(guó)劍橋大學(xué)血液系輸血醫(yī)學(xué)部AIlain教授開始關(guān)注隱匿性HBV感染[9·2],積極倡議并組織oBI國(guó)際協(xié)作研究「13]。筆者于2005年起作為劍橋大學(xué)oBI項(xiàng)目主要研究者,建立了OBI毒株DNA擴(kuò)增方法[”],協(xié)助Allain教授組織開展OBI國(guó)際合作研究,于2007年回國(guó)后開始我國(guó)流行的OBI生物學(xué)特性研究li∶。幾年來(lái),Allain教授領(lǐng)尋的團(tuán)隊(duì)研究分析了歐洲、北美洲、非洲、亞洲等地區(qū)獻(xiàn)血人群中流行的()BI毒株基因型A1、A2、B、C、D、E(()BIA1、OBIA2、O~BIB、OBIC、OBID、0BIE)的分子生物學(xué)特性,揭示了OBI產(chǎn)生的可能機(jī)制,完成了階段目標(biāo),主要結(jié)果發(fā)表在國(guó)際專業(yè)期刊i12I。然而,這些主要基于OI3I毒株分子生物學(xué)特性提出的0BI產(chǎn)生與存在的科學(xué)假說(shuō),仍需進(jìn)一步研究證實(shí),特別是針對(duì)我國(guó)流行的OBI基因型B和C(O-BIB和0BIC)的研究。在承接OBI國(guó)際合作研究進(jìn)展基礎(chǔ)上,我國(guó)輸血醫(yī)學(xué)工作者應(yīng)針對(duì)本地區(qū)HBV流衍特點(diǎn),進(jìn)一步揭示病毒蛋白氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)突變:與OI3I的相關(guān)性,跟蹤分析(汜I毒株在我國(guó)獻(xiàn)血人群體內(nèi)病毒復(fù)制動(dòng)態(tài)、遺傳變異和分子免疫特征,闡明OBIB和OBIC在體內(nèi)發(fā)生發(fā)展的主要分子機(jī)制,為血液篩查與血液安仝控制提供理論與技術(shù)支持。 
        2 隱匿性乙型肝炎病毒感染研究現(xiàn)狀發(fā)達(dá)國(guó)家和部分發(fā)展中國(guó)家已將獻(xiàn)血者HIV、HCV和HBV病毒核酸檢測(cè)納人血液篩查規(guī)程,以減少病毒窗「l期感染和OBI在內(nèi)的隱匿性感染。目前,在我國(guó)血液安傘篩查中已開始了病毒核酸篩查試點(diǎn)工作,但尚未全面展開、僅以HPlsAg檢測(cè)作為HBV篩查的指標(biāo)難以檢出窗冂期和OBI,仍存在較高的HBV感染殘余風(fēng)險(xiǎn)?。通常OBI的病毒載量極低,介于10{1U/ml和不可定量之間,中位數(shù)值在102IU/ml以下3回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)OBI確實(shí)可以傳播HBV[17]。在被感染的個(gè)體免疫功能受抑時(shí),隱匿性的HBV可能再次復(fù)制,轉(zhuǎn)化為典型的乙型肝炎。OBI流行于世界各地,流行率差異較大,介于l:672至1:20166,與HBV流行率成正相關(guān)。通過(guò)對(duì)深圳地區(qū)165371例HBsAg陰性獻(xiàn)血者的調(diào)查顯示,深圳獻(xiàn)血人群OBI流行率為1:7517[15],低于西非加納(1:67)[14],高于歐洲(1:9819)甚至南非(1:8⒛9)流行率f161:]。鑒于深圳地區(qū)HBV流行率(約1%)遠(yuǎn)低于全國(guó)HBV流行率平均水平(7.2%)[z’z4],推測(cè)我國(guó)人群整體oBI流行率至少在1:7517以上。 
        隱匿性HBV感染還常見于各類HBsAg陰性的肝病及其他疾病患者中,與重癥肝損傷和肝細(xì)胞癌有關(guān)“創(chuàng)。我們新研究發(fā)現(xiàn),HBV感染者可以引起接種過(guò)疫苗免疫的配偶產(chǎn)生oBI[23]。我國(guó)及其他地區(qū)這種高HBV流行率是否與oBI傳播HBV有關(guān)Ez°],以及OBI長(zhǎng)期存在與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系陽(yáng)l,都需要更深人和細(xì)致的研究。Allain教授于⒛03年研究報(bào)道了HBsAg-/DNA+獻(xiàn)血者傳播HBV的風(fēng)險(xiǎn)[27]。自此,我們對(duì)歐洲、北美、非洲和亞洲地區(qū)流行的oBI分子生物學(xué)特性進(jìn)行系列研究報(bào)道[3δ叼4∶,揭示了部分OBI產(chǎn)生的可能機(jī)制。其他為數(shù)不多的研究,從不同側(cè)面報(bào)道了中國(guó)大陸[2:3°]、臺(tái)灣[⒒32]、香港Ⅱ、韓國(guó)31∶、西歐:333:J等地區(qū)人群的肝細(xì)胞瘤、造血干細(xì)胞或獻(xiàn)血者中OBI流行狀況,個(gè)別研究進(jìn)行了oBI毒株s蛋白分子生物學(xué)[3°J91和免疫學(xué)特性分析[373:]。 
        3 0BI的主要分子生物學(xué)特征及形成機(jī)制迄今為止,我們對(duì)全球主要oBI基因型A1、A2、B、C、D、E毒株的分子生物學(xué)特性已初步了解。歸納研究結(jié)果與相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn),OBI毒株各基因型與血清H隊(duì)Ag陽(yáng)性HBV野毒株比較,具有以下主要分子生物學(xué)特征:

        3.1 基因調(diào)控序列堿基變異(Mutationsinv⒒alregulat∝ryelcmems)OBI基因型C毒株的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子核苷酸調(diào)控序列(SP1、sP2、ENH1和ENH2)與野毒株HBV基因型C比較變異非常顯著,而OBI基因型B和E的相應(yīng)調(diào)控序列保守。OBI基因型A1、B、C、E的核心蛋白調(diào)控序列(主要包括核心蛋白上游調(diào)控序列,CURS;基礎(chǔ)核心蛋白啟動(dòng)子,BCP)與野毒株比較,存在關(guān)鍵位點(diǎn)變異或突變,包括缺損、插人、置換等,如BCP內(nèi)的A1762T/G1764A雙突變「:1。這些變異或突變被認(rèn)為會(huì)阻礙HBV基因型A1、B、C和E毒株復(fù)制或蛋白合成缺損,是導(dǎo)致OBI產(chǎn)生的原因[lⅡⅡdr,而OBI基因型A2和D毒株的這些調(diào)控序列變異不明顯[1′1:∶。 
        3.2 剪接機(jī)制剪接機(jī)制可以產(chǎn)生重組或新蛋白(rec。mbinantorneo—protein),作用于轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、翻譯或基因組及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程,從而導(dǎo)致基因組或結(jié)構(gòu)蛋白水平下降,形成OBI「39「。preS2鸕mRNA剪接可以產(chǎn)生非功能性的smRNA,進(jìn)而編碼截短的或雜合的HB蛋白,因而使功能性的非剪接pres2/smRNA水平降低,HBsAg的表達(dá)水平相應(yīng)降低。對(duì)5′S剪接供體位點(diǎn)堿基突變(Nuclcotidcmutatlo¨attlles5′sp1kcdonorske)的研究發(fā)現(xiàn),prcs2鸕mRNA剪接對(duì)于HBsAg表達(dá)是必要的。40%左右的OBI基因型A1、B和C毒株,其pres2鸕剪接供體位點(diǎn)或附近核苷酸發(fā)生突變,改變剪接供體的結(jié)構(gòu),影響Pres2/SmRNA剪接,相應(yīng)的表面蛋白抗原(H隊(duì)Ag)表達(dá)降低或受到阻斷[1:’24]。這種導(dǎo)致HBsAg表達(dá)水平降低是否與基因型無(wú)關(guān)[24],還需對(duì)OBI其他基因型A2、D和E分析判定。雖然剪接在功能性的非剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及HBsAg的表達(dá)水平上所起的作用還不十分確切,但它包括在共轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制中,成為0BI的一個(gè)分子生物學(xué)特征Lz1]。 
        3.3 表面蛋白抗原氨基酸突變研究早已證實(shí),HBV表面蛋白(Prcs/s)氨基酸突變,特別是主要親水區(qū)(MHR)或“a”區(qū)關(guān)鍵氨基酸諸如G145R/A突變等,可以導(dǎo)致HBV逃避免疫或檢測(cè)。OBI各基因型毒株P(guān)res/s氨基酸序列與野毒株比較均有顯著變異[l^·:加]。采用EI'⒙A測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中HBsAg水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,oBI毒株HK8663、HK3110和TW6083的S蛋白基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的HBsAg水平顯著低于HBV野毒株,表明SmRNA剪接位點(diǎn)突變影響s蛋白表達(dá)[24]。然而,OBI各基因型表面蛋白抗原(HBsAg)變異的意義確有不同。OBI基因型A2和D毒株的表面抗原的MHR或“a”區(qū)氨基酸有多個(gè)關(guān)鍵氨基酸的頻繁發(fā)生突變[1620,23],變異率高;B和C型居中,A1和E變異率低[14J。J引。研究認(rèn)為oBI基因型A2和D毒株S蛋白受到宿主免疫壓力發(fā)生突變,是OBI生成并以低病毒載量存在而逃避宿主免疫清除的主要原因[!6J盯。在前期工作中,對(duì)C121、C124、C137等位置的半胱氨酸(Cystone)突變糾正,通過(guò)體外細(xì)胞模型重建了HBsAg反應(yīng)性,證實(shí)關(guān)鍵氨基酸突變可以引起HBsAg發(fā)生改變,導(dǎo)致HBsAg檢測(cè)反應(yīng)性降低,是oBI逃避免疫清除的原因之一[l叨。另外,表面蛋白抗原氨基酸突變導(dǎo)致HBsAg表達(dá)量極低或分泌障礙也是oBI形成的原因之一。zO13年Blsw灬和Candotti"]將18例OBI克隆在體外Huh7細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)染,按照HBsAg的表達(dá)量和分泌方式將0BI分成3種模式,Pattem1、2和3。HBsAg存在分泌障礙只殘留于細(xì)胞內(nèi)的Pattcm2占6/18,HBsAg在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外表達(dá)量都很低的Pattem3占7/18。通過(guò)對(duì)OBI克隆進(jìn)行點(diǎn)突變及修復(fù)(ste_dlrected-mutagenesiscorrectedmutatons),證實(shí)了M75T、P178R的突變與HBsAg的分泌障礙相關(guān)[43]。 
        3.4 核心蛋白氨基酸突變我們?cè)趏BI基因型B和C毒株核心蛋白(Pre￡ore/Core)氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)多個(gè)有意義突變E15·24],而0BI基因型A1、A2、D和E毒株則少見。在有關(guān)HBVMxA的研究中發(fā)現(xiàn),MxA可以通過(guò)與Core蛋白相互作用抑制HBV復(fù)制[44],反之Core蛋白某些氨基酸突變又可以抑制MxA基因轉(zhuǎn)錄[45]。這些發(fā)生在病毒核心蛋白的重要突變,是否在0BI生成中起到重要作用還需進(jìn)一步探索。 
        3.5 pgRNA或mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核障礙pgRNA或mRNA從細(xì)胞核到胞漿依賴于甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPHD〉、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(PRE)和多嘧啶序列結(jié)合蛋白形成的復(fù)合體:。PRE區(qū)域的突變或部分缺失可能導(dǎo)致RNA貯存于細(xì)胞核內(nèi),無(wú)法翻譯。目前已報(bào)道的OBI患者中發(fā)現(xiàn)的preS2/SmRNA剪接,5′s剪接供體位點(diǎn)相對(duì)保守,位于458位。3′S剪接受體位點(diǎn)已發(fā)現(xiàn)1305/1308/1361/1385等位點(diǎn)I39邛〗,部分位于PRE區(qū)域內(nèi),因此可能影響pgRNA或mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核,蛋白翻譯水平降低或阻斷。 
        4 OBI產(chǎn)生與存在的宿主因素有關(guān)OBI產(chǎn)生與存在的宿主因素,特別是宿主遺傳免疫方面的直接研究數(shù)據(jù)還十分缺乏。近有研究報(bào)道,抗一HBc陽(yáng)性與陰性oBI感染者對(duì)HBV的保護(hù)性免疫反應(yīng)不同,抗一HBc陽(yáng)性者T細(xì)胞特異性反應(yīng)與HBV感染康復(fù)者相似[17]。另一篇研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),約30%~40%的0BI獻(xiàn)血者對(duì)HBsAg、HBcAg和HBeAg有免疫反應(yīng),其特異性CD4與CD8介導(dǎo)的T細(xì)胞分泌干擾素γ(IFNγ)水平也與HBV感染康復(fù)者相似[a:l。然而,這些具有高度變異的OBI毒株的存在,是否為機(jī)體特異性免疫控制的結(jié)果尚有待證實(shí)。研究表明,B、Th等細(xì)胞參與HBV免疫反應(yīng),并受宿主HI'A限制[1:j。h述oBI毒株的核心蛋白或囊膜蛋白的重要突變位點(diǎn),可能涉及HBV的B、Th和CTI'免疫表位。在HBV感染中,核心蛋白突變不僅與重癥肝損傷相關(guān),還與HBV顆粒低水平分泌以及Th和CTI'免疫逃避表位有關(guān):1ρ和J。核心蛋白Core1827、8896與14⒈151構(gòu)成了CTI'表位簇,其中S21I冫突變報(bào)道為CTL免疫逃避突變,與HBV低載量的HBeAg陰性患者相關(guān)。s26A、L95I、T142M等CTL表位突變受HI'AA2、HI'A-A11或HI'A-Aw68限制[195⒈52j,可能由免疫壓力所致。在對(duì)深圳和東南亞獻(xiàn)血者OBI基因型B和C毒株的核心蛋白序列分析中,也發(fā)現(xiàn)上述表位內(nèi)的諸多位點(diǎn)變異,但與OB1宿主的遺傳免疫的確切關(guān)系需進(jìn)一步研究闡明。HBV表面抗原(HhAg)是囊膜蛋白的組成部分,包括PreS1、Pres2和s蛋白(Pres/S)。Pres/s是HBV診斷和疫苗免疫的重要靶蛋白,包括B、Th和CTI'表位,特別是s蛋白的“a”區(qū)誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生。OBI基因型A2和D毒株表面蛋白抗原氨基酸突變『162°,23]發(fā)生在這些免疫表位內(nèi),可能是oBI毒株逃避宿主免疫存在的原因。 
        5 OBI研究方向與展望我國(guó)是乙型肝炎高發(fā)國(guó)家,以HBV基因型B和C流行為主,西部少數(shù)民族地區(qū)存在一定比例的基因型D。廣東地區(qū)的HBV基因型主要為B和C,其中B型稍多于C型13。然而,我國(guó)大陸報(bào)道的oBI確認(rèn)樣品數(shù)約80份,其中僅約10份進(jìn)行了全基因組序列分析[I5·28,30]。加之中國(guó)香港和臺(tái)灣以及東南亞地區(qū)報(bào)道的約140份OBI樣品,總計(jì)約220份OBI基因型B和C樣品,其中經(jīng)全基因組DNA序列分析的樣品不足60份。這些OBI基因型B和C資料,特別是我國(guó)大陸的第—手資料還不足以完全揭示OBI基因型B和C的分子生物學(xué)特性。從獻(xiàn)血者OBI基因型B和C病毒株分子生物學(xué)特性和宿主遺傳免疫兩個(gè)方面研究,闡明OBI發(fā)生發(fā)展的主要分子機(jī)制,可為包括疫苗免疫人群在內(nèi)的⊙BI:和OBIc監(jiān)測(cè)與防控策略提供重要依據(jù),評(píng)價(jià)我國(guó)正在試點(diǎn)開展的獻(xiàn)血者病毒核酸篩查(NAT)效果,以及研究和分析OBI與臨床重癥肝病或腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系和個(gè)性治療方案提供理論指導(dǎo)。