亞甲藍光化學法病毒滅活對血漿成分及 白細胞殘留量的影響

         輸血是臨床搶救和治療患者的重要手戥之一,但也具有傳染疾病的危險。血液成分中傳播病毒危險性大的是白細胞,其次為血漿,因此對血漿進行病毒滅活并濾除白細胞成為保障輸血安全的主要措施之一。目前,我國采供血機構對血漿進行病毒滅活,常用方法是亞甲藍光化學法(methylenebluephot°chem“try,MBP),該方法在歐洲國家中應用較為普遍[I],是我國目前獲準用于臨床的光化學血漿病毒滅活技術。M⒊P幾乎可滅活所有細胞外的脂質包膜病毒,但對細胞內的病毒不具各滅活作用,因此采用MBP滅活血漿病毒的同時,還要對血漿中的白細胞進行濾除[2]。M⒊P在病毒滅活過程中對血液成分的結構和功能可能有一定的影響,Williamson等[3]總結了多項研究中亞甲藍光化學病毒滅活對血漿成分的影響、凝血因子等的活性減少可達4%~32%。為了解常規(guī)工作流程下病毒滅活血漿中主要凝血因子等的狀況,研究病毒滅活過程對血液質量的影響,現(xiàn)對病毒滅活前后的血漿進行抽樣檢測,報告如下。 
         材料與方法 
         1 標本來源均來源于淮北市中心血站⒛13年6月無償獻血血液標本,隨機抽取應用去白細胞四聯(lián)袋采集的30份400ml全血,利用采血后6h內的制各新鮮血漿,在百級凈化間內無菌連接血漿袋和病毒滅活過濾器,使血漿緩慢通過MB添加元件,血漿中亞甲藍終濃度為1um。l/L,將含有亞甲藍的血漿流入病毒滅活耗材的一個空袋中,混勻后留樣10ml備檢。然后將加人亞甲藍的血漿置4C病毒滅活箱的擱架上,擺動頻率60次/mlll,利用30000~35000LX光照強度的可見光照射30min,將光照后的血漿通過病毒滅活過濾器濾除殘余的亞甲藍和白細胞,混勻后留樣10ml備檢。 
         2 主要儀器與試劑四聯(lián)采血袋(山東威高醫(yī)用品股份有限公司,批號1304282),含有MB添加元件的病毒滅活柜配套一次性病毒滅活血袋(上海輸血技術有限公司,批號130307),凝血因子Ⅱ、V、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、X、Ⅺ、Ⅻ活性和纖維蛋白原(Fg)含量的測定試劑盒(SIEMENS,批號546553A),總蛋白(TP)試劑盒(上海科欣生物技術研究所,批號20130405),6000I離心機(德國賀利氏),DXZⅡ型低溫操作臺(鄭州飛龍醫(yī)療設各有限公司),CA50全自動血凝儀(日本Sysmex公司),HDME1A型醫(yī)用血漿病毒滅活柜(上海輸血技術有限公司)。 
         3 凝血因子和總蛋白含量的檢測凝血因子Ⅱ、V、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、X、Ⅺ、Ⅻ的活性及Fg含量測定采用血凝儀,TP含量測定采用雙縮脲法,嚴格依據檢測試劑說明書操作。 
         4 白細胞計數采用Nageotte血細胞計數板計·291·數。白細胞濾除率=(濾除前血漿白細胞數-濾除后血漿白細胞數)/濾除前血漿白細胞數×。 
         5 統(tǒng)計方法采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理,計量數據以均數±標準差(Ⅰ±s)表示,處理前后各指標的比較采用配對矽檢驗。 
         結果

         1 對血漿中凝血因子的影響經亞甲藍光化學法處理30min后,血漿中凝血因子活性在處理后均有不同程度的損傷,多數在80%以上。血漿凝血因子V和Ⅷ活性減少明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其他凝血因子活性減少不明顯(P<0.05),

         2 對血漿Fg和TP含量的影響血漿中Fg含量【g/L)下降了8.02%,TP含量(g/I')僅下降了3.91%,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),

         3 白細胞濾除效果白細胞濾除前新鮮血漿含有白細胞數為(5.72±1.56)×106個/U,白細胞濾過和亞甲藍光照處理后新鮮血漿白細胞殘留量(1.14±0.37)×104個/U(″=30),白細胞去除率>99.80%。 
         討論

         MBP是一種安全、有效,適用于單袋血漿病毒滅活的方法:l,M⒊P在滅活病毒的同時可能對凝血因子和蛋白有一定的負面作用,造成血漿有效成分的損失[5]。本次研究表明,血漿病毒滅活前、后有效成分的含量發(fā)生改變。M⒊P可使血漿中的凝血因子含量降低,對穩(wěn)定凝血因子及血漿蛋白影響不大。血漿凝血因子FⅡ、FⅦ、FⅨ、FX、FⅪ和FⅪ的回收率分別為91.11%、91.08%、89.14%、92.63%、90.79%和93.60%,血漿Fg和TP回收率分別為91.98%和96.39%,病毒滅活前后差異無統(tǒng)計學意義。不穩(wěn)定的凝血因子FⅤ和FⅧ活性明顯降低,回收率分別為84.19%和82.56%,差異有統(tǒng)計學意義,但仍在國家質量標準允許范圍內(新鮮冰凍血漿Ⅷ含量≥0.7IU/ml;病毒滅活新鮮冰凍血漿Ⅷ含量≥0.5IU/ml)。其主要原因是FⅧ、Fv屬不穩(wěn)定凝血因子,離體后受外界的溫度及離體時間的影響,外界溫度越高,離體時間越長,含量或活性下降越明顯。另一方面,亞甲藍在可見光照射時產生的自由基(一類機制),或單線態(tài)氧(二類機制)氧化損傷病毒分子結構使其核酸斷裂、復制終止的同時,也對血漿一些蛋白成分造成損傷[6]。文獻[7’引認為光照強度30000Lux、光照時間30min,溫度(4±2)C的MBP處理條件既可有效滅活病毒又對凝血因子活性改變影響小,該條件對外源性凝血系統(tǒng)影響不大,但對內源性凝血系統(tǒng)(主要是FⅧ)有一定影響。馬改娣等[9□也證實經亞甲藍滅活后血漿FⅧ:C和Fv:C比滅活前活性均明顯降低,與本次研究結果基本相同。實驗所用的MBP血漿病毒滅活方法不僅破壞了病毒穿透、復制及感染能力,抑制了病毒的傳播,同時還濾除了血漿中殘留的白細胞。血制品中殘留白細胞含量與輸血安全性密切相關。白細胞內不僅含有潛在的致病因子,同時還與非溶血性發(fā)熱反應、HI冫A同種免疫、血小板輸注無效等疾病相關。研究表明:一般每單位血漿中殘余白細胞的數量約為105~107,濃度雖不高,但仍可導致與白細胞相關的輸血不良反應,更重要的是可攜帶如巨細胞病毒(CMV)、人類嗜T淋巴細胞病毒I型(HTLVI)、皰疹病毒(HTV)等輸血相關病毒[lO]。由于白細胞在血制品保存過程中產生的細胞因子等生物活性物質無法用白細胞濾器濾除,所以保存前給予濾除,既可以減少由白細胞數量和相關代謝產物所導致的不良輸血反應,也可避免由親白細胞病毒、微生物等傳染性病原體導致的血源性感染。因此各國對血制品中殘留白細胞的含量均有嚴格的限定。歐洲現(xiàn)行標準是每個血制品包裝中應少于1×106個白細胞。M⒊P法中的白細胞濾除屬于儲存前過濾,因為在8~72h內過濾血液,白細胞沒有破碎,也未釋放出細胞因子,經MBP滅活的血漿白細胞含量降至104個,大限度地降低了輸血不良反應的發(fā)生,大大提高了血漿輸注的安全性E5]。本試驗中新鮮血漿經新型聯(lián)袋一次性使用去白細胞輸血濾器濾除,結果顯示經MBP滅活血漿,每袋血漿約210~230ml,滅活后血漿中白細胞數量由(5.72±1.56)×106個/U下降到(1.14±0.37)×104個/U,白細胞去除率>99.80%,白細JChnTransfusLabMed,July。2014,V°116,N°。3胞數量降低2個數量級,可有效預防非溶血性發(fā)熱反應、HLA同種免疫及親白細胞病毒的傳播[6]。血漿是可發(fā)生經輸血傳播疾病的主要血液成分之一,近年的用量持續(xù)增加,因此在保證血漿臨床輸用安全的同時,提高血漿質量和應用效果是非常重要的。本研究表明,經過亞甲藍光化學技術滅活病毒的血漿,對血漿成分的影響較小,滅活后的血漿符合國家相關標準,可以滿足臨床安全輸血的需求,對提高輸血安全水平有一定的作用。 
         參考文獻 
         1 王飛,路志浩,古醒輝,等。亞甲藍光化學法血漿病毒滅活前后血漿成分的變化D].臨床輸血與檢驗,2010,12(2):97-100。 
         2 趙莉,趙燕.聯(lián)合應用濾除白細胞和亞甲藍光化學病毒滅活對新鮮血漿成分的影響D].中國輸血雜志,2011,24(8):679-682。 
         3 鐘銳,劉嘉馨,曹曄,等。亞甲藍光化學法對血漿凝血因子活性的影響研究EJ△中國輸血雜志,⒛11,24(1):4042

         4 宋敏,趙樹銘,劉鳳君,等。亞甲藍血漿病毒滅活對凝血因子的影響EJ]。重慶醫(yī)學,2012,41(11):1092△094.

         5 馬改娣,張關萍,田志彬,等。病毒滅活對血漿中各種成分回收率的影響D].中國輸血雜志,⒛09,22(3):21⒏219.

         6 李卉,李健,楊麗,等。白細胞濾除對新鮮冰凍血漿質量影響的研究EJ].北京醫(yī)學,⒛09,31(12):74⒍748.