兒童原發(fā)性限制型心肌病三例的臨床特征及遺傳分析

         限制型心Hl1病(RCM)是以b室充盈受限和舒張功能障礙為特征的一類`b肌病,主要表現(xiàn)為心室舒張未升高和b房擴大,而心室大小、室壁厚度和心室收縮功能大致正常與擴張型`b肌病(DCM)和肥厚型`b肌病(HCM)相比,RCM發(fā)病率較低,在兒童`b肌病中僅占3%~5%,但其預(yù)后較差,確診后平均生存周期僅為2年"由于原發(fā)性RCM發(fā)病率低,相關(guān)研究不多.發(fā)病機制H前仍不清楚,原發(fā)性RCM患者巾30%呈家族性,提示遺傳因素是其亙要病岡:自2003年第l次報道在RCM患者中發(fā)現(xiàn)TNNI3基岡突變3以來,已發(fā)現(xiàn)了8個肌節(jié)蛋白基閃突變與RCM有關(guān)3^,以TNN"、TNNI3、M、H7、ACTC皋丨村突變?yōu)橹?提示肌節(jié)蛋白基因突變是原發(fā)性RCM的重要遺傳基礎(chǔ).岡此,在排除了炎癥浸潤、糖原代謝病、彈力纖維增生癥、淀粉樣變性等繼發(fā)性疾病后,對原發(fā)性RCM患者開展肌節(jié)蛋白基岡突變篩查,對揭示RCM的發(fā)病機制具有重要意義Ⅱ本研究對確診的3例原發(fā)性兒童RCM的臨床特征進行總結(jié)分析,并進行肌節(jié)蛋白基因突變篩查,以期發(fā)現(xiàn)RCM發(fā)病的分子基礎(chǔ).
         資料與方法 
         1研究對象:共收集了3例RCM先證者及其家族成員資料,其中病例1和病例2來自加拿大醫(yī)院心臟中心,病例3來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院心臟科c先證者均接受心電圖、超聲`b動圖、心臟核磁共振成像(MRI)和(或)心導(dǎo)管及各項實驗室檢查,排除染色體異常、骨骼系統(tǒng)、糖原累積癥、彈力纖維增生癥及淀粉樣變性等疾病.所有患兒的父母及同胞均經(jīng)超聲b電圖、心電圖等排除心臟疾病:RCM超聲診斷標準"°:左、右心房增大,心室壁正?；蜉p度肥厚,心室內(nèi)徑正常;左b室舒張功能障礙,收縮功能正常;多普勒提示左`b室限制型mL流頻譜:脈沖多普勒測量二尖瓣口lll流頻譜E峰及A峰的峰值速度E/A比值≥2,E峰斜率時問(DT)縮短(≤150ms),左`b室等容舒張期縮短(≤70ms)另選擇于我院門診體檢的10O名健康兒童為正常對照,其中男、女各50名.
         本研究獲得患兒所在醫(yī)院道德倫理委員會批準,所有研究對象或監(jiān)護人均獲知情同意i2.患兒`b肌組織病理檢查:經(jīng)知情同意,分別對病例l和病例2行經(jīng)`b導(dǎo)管心內(nèi)膜心肌活檢c采用標準實驗方法.對活檢心肌組織分別進行常規(guī)組織學(xué)染色干Π投射電鏡檢查「3肌節(jié)蛋白基岡突變篩查:采集研究對象外周雨L提取基囚組DNA使用phme3軟件對TNNT2、TNNB、ACTC、MYH7基岡所有編碼序列及內(nèi)含子一外顯子拼接部位設(shè)計引物.聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增RCM患兒目的基岡片段并純化,直接雙向測序,通過對照基囚測序圖譜、DHPLC檢測結(jié)果以及與GenBank序列比對確定突變位點,使用Muhahn在線軟件對比分析突變氨基酸的保守性.如發(fā)現(xiàn)突變,進一步檢測該突變在家族成員及正常對照兒童的分布情況:
         結(jié)果
         1.患兒臨床特征分析結(jié)果:病例1,為一名12歲女孩,患兒出生后即囚心臟雜音就診發(fā)現(xiàn)膜部室間隔缺損(缺損大小約2mm),隨訪18個月除發(fā)現(xiàn)室間隔缺損持續(xù)存在、左心室稍大外,新發(fā)現(xiàn)左、右心房增大,肺靜脈內(nèi)異常反流,左心室收縮功能正常而舒張功能障礙.患兒于3歲時接受`b導(dǎo)管檢查顯示左`b室舒張期壓力達16mmHg(lmmHg=0133kPa),右`b室壓力達左心室壓力的50%.心臟MRI進一步排除`b包異常及心肌肥厚.經(jīng)心內(nèi)膜心肌活檢及其他各項檢查后,患兒被診斷為原發(fā)性RCM合并室間隔缺損.患兒于8歲時漸出現(xiàn)勞力性呼吸困難,心電圖提示P波增高增寬,下壁導(dǎo)聯(lián)ST段下移;超聲心電圖顯示左心房進一步增大,呈限制型血流頻譜,左心室舒張功能嚴重受損(圖1a).再次心導(dǎo)管檢查發(fā)現(xiàn)左心室舒張期壓力升高至"23mmHg.后患兒服用阿替洛爾,但癥狀仍進行性加重,目前紐約心功能分級(NYHA分級)Ⅲ級,等待心臟移植.病例2,女孩,既往體健,11歲時因勞力性呼吸困難就診,心電圖顯示竇性心律,左心房增大,心室肥厚,廣泛的T波改變.超聲心動圖示左心房顯著增大,左心室舒張期內(nèi)徑和收縮功能正常,室間隔輕度肥厚,無心室局部反向運動,無左心室流出道梗阻,左心室舒張功能嚴重受損,呈典型的限制型血流頻譜——左心房血流充盈速麂減低(0.笏m/s,正常>0.5m/s),DT縮短(1"ms,正常>150ms),E/A比值升高(E/A=2.32,正常<2),ⅣRT明顯縮短(25ms,正常)TOms).心臟MRI進一步證實左心房顯著增大,心室內(nèi)徑正常,室間隔中下段輕度肥厚(約為15mm),并排除心包疾病.
         改良Bmce運動試驗中出現(xiàn)胸痛和廣泛顯著的sT段下移.心導(dǎo)管檢查提示患兒心臟指數(shù)正常,左、右心室舒張期壓力顯著升高.經(jīng)心內(nèi)膜心肌活檢等各項檢測,排除相關(guān)繼發(fā)因素后,患者被診斷為原發(fā)性RCM合并室間隔中下段輕度肥厚.患兒接受了口服美托洛爾(2mg·kg·d)和阿司匹林(80mg,每日3次)治療,但病情仍進行性加重,氣促明顯并頻繁胸痛(NYHA分級Ⅲ級).患兒終于首診后15個月接受了心臟移植,目前已隨訪4年,一般情況良好.
         病例3,為一名I1歲女孩,既往體健.患兒10歲時因活動后氣促、胸悶就診,超聲心動圖發(fā)現(xiàn)左、右心房明顯增大,心室內(nèi)徑及室壁厚度正常,左心室收縮功能正常,左心室舒張功能下降;彩色多普勒示限制型血流頻譜.心臟MRI進一步證實上述改變,并排除心包異常.心電圖顯示竇性心律,雙心房增大,廣泛的T波改變.患兒氣促漸加重,出現(xiàn)全身水腫,后予地高辛、卡托普利及利尿劑等口服,水腫好轉(zhuǎn),目前已隨訪1年余,仍活動受限,YHA分級Ⅱ級.2,患兒組織學(xué)檢查結(jié)果:組織學(xué)檢查提示病例1存在廣泛的心肌細胞排列紊亂和纖維化,電鏡顯示肌節(jié)數(shù)量減少,線粒體顯著增大變形(圖2).病例2`心肌細胞輕度肥厚和間質(zhì)纖維化,進一步透射電鏡檢查顯示Z線排列紊亂,間距不規(guī)貝刂(圖3).
         3.遺傳學(xué)檢測結(jié)果:對病例1檢測發(fā)現(xiàn)了TNNI3基因第8外顯子α611G>A雜合突變造成第204位精氨酸突變?yōu)榻M氨酸("04H),該突變在HCM及RCM患者中均被報道過(圖1b).在病例2中發(fā)現(xiàn)了TNN"基因第9外顯子⒍"7-302AATGAG雜合缺失突變,造成第100、101號氨基酸缺J走(p.Asn100~αu101del,100~101delNE),該突變目前尚未被報道(圖4a).在病例3中發(fā)現(xiàn)了TNNI3基因第8外顯子⒍575G>A雜合突變造成第192位精氨酸突變?yōu)榻M氨酸(R192H),該突變在RCM和HCM患者中均被報道過(圖1b).蛋白序列比對發(fā)現(xiàn),所有突變所處氨基酸在多個物種高度保守(圖lb、圖4b).所有突變只在病例本人中出現(xiàn),而在其父母及正常對照兒童中均未檢測到.除上述突變外,未發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的其他候選基因突變.
         討論
         心肌肌節(jié)蛋白基因突變是HCM和DCM發(fā)病的重要遺傳基礎(chǔ),目前至少已發(fā)現(xiàn)13個致病基因,與DCM有關(guān)的突變位點約20多個;而與HCM有關(guān)的突變位點達200多個["45],其中超過SO%集中在MYBPC3、MYH7、TNNI3、TNNI,、TPM1基因.由于RCM發(fā)病率低,且多為散發(fā),目前研究報道不多.自2003年Mogensen等[3]通過對家族性RCM連鎖分析發(fā)現(xiàn)TNNI3基因突變以來,已發(fā)現(xiàn)了8個肌節(jié)蛋白基因3化圖維突變,主要分布在TNN"、TNNI3、MYH7、ACTC等基因.
        

         原發(fā)性RCM診斷較為困難,需排除限制型心包炎、瓣膜疾病、心肌炎癥浸潤、糖原代謝病、彈力纖維增生癥、淀粉樣變性等各種繼發(fā)性疾病.與DCM和HCM相比,原發(fā)性RCM發(fā)病率低,但進展快、預(yù)后差,尤其是兒童RCM.Peddy等[7]報道1例12個月女嬰RCM,發(fā)病后迅速進展出現(xiàn)嚴重心力衰竭,先后接受體外膜肺(ECMo)、雙心室輔助裝置(ⅤAD)治療,并終于起病半年后接受心臟移植,遺傳學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)了TNNI3基因突變.與既往報道相似,本研究報道的3例兒童RCM患者,均以氣促、體力活動受限起病,進行性加重,迅速出現(xiàn)心力衰竭.對RCM患者遺傳分析的報道提示肌節(jié)蛋白基因突變所致RCM進展快、預(yù)后差.既往在對不同種族心肌病患者的研究中,均發(fā)現(xiàn)了肌節(jié)蛋白基因突變.本文病例3是漢族女童,存在TNNI3基因R1叼H突變,其臨床特征與國外報道一致.
         原發(fā)性心肌病具有臨床表型和遺傳異質(zhì)性的特點,部分患者心肌病的臨床表型存在重疊性,不同類型的心肌病可能由同一基因不同功能區(qū)域突變引起,而同一突變可引起不同類型心肌病["∶.由于RCM和HCM具有一些共同的臨床特征,如均表現(xiàn)為心室舒張功能障礙,心肌收縮力正?；蛟鰪?且少數(shù)患者可同時出現(xiàn)RCM和HCM特征,提示二者可能具有共同的遺傳基礎(chǔ).如TNNI3基因R204H突變在HCM和RCM中均被報道過[16].Rai等"]報道一RCM家系,其中部分RCM患者合并HCM,遺傳檢測發(fā)現(xiàn)了TNNI3基因R192H突變.本文中病例2同時合并室間隔中下段心肌肥厚,心肌活檢顯示存在輕度心肌肥厚,基因檢測發(fā)現(xiàn)TNN"基因突變.因此,正如2006年美國心臟病協(xié)會(AHA)和2008年歐洲心臟病學(xué)學(xué)會(E℃)心肌病新的分類所強調(diào)的,我們應(yīng)重視遺傳因素在心肌病分類中的作用.
         對病例1和病例3的遺傳分析分別發(fā)現(xiàn)了TNNI3基因"04H、R1呢H笑變,突變所在序列在多個物種高度保守.Neumayer等[I:]在1998年報道了一些小型膜部室間隔缺損患者成年后發(fā)展為RCM,后有研究發(fā)現(xiàn)肌節(jié)蛋白基因突變除導(dǎo)致心肌病外,還可引起先天性心臟病[I990].本研究中病例1合并室間隔缺損,再次提示心肌病變和先天性心臟結(jié)構(gòu)異?？梢源嬖诠餐倪z傳基礎(chǔ).這是目前為止較早報道TNNI3基因突變與先天性心臟病相關(guān)的研究.Rz04H突變早發(fā)現(xiàn)于HCM患者,2000年報道發(fā)現(xiàn)于一例接受心臟移植的年輕RCM女性患者[16];2003年報道于1名19歲的男性RCM患者發(fā)現(xiàn)R192H突變[3],后又有研究在RCM合并HCM家系中發(fā)現(xiàn)了該突變[17].Rz04H和R192H突變預(yù)后均較差,病情進展迅速.
         肌鈣蛋白復(fù)合體是心肌收縮、舒張活動中重要的功能成分,由肌鈣蛋白T與肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I共同組成,其中肌鈣蛋白C與Ca2+結(jié)合,肌鈣蛋白I可以抑制肌動蛋白與肌球蛋白的相互作用,而肌鈣蛋白T可以將肌鈣蛋白復(fù)合體與原肌球蛋白(Tm)和肌動蛋白相連,共同形成鉸鏈樣結(jié)構(gòu),對Ca2+的調(diào)節(jié)及肌肉的收縮起重要作用.研究發(fā)現(xiàn),肌鈣蛋白基因突變主要通過影響心肌纖維對C'+的敏感性、損害心肌舒縮功能而造成心肌病變,如對%2+的敏感性增加可導(dǎo)致HCM和RCM,對Ca2+的敏感性減低則可導(dǎo)致DCM[21].
         TNNI3基因R192H突變位于肌動蛋白與肌鈣蛋白I結(jié)合區(qū)域,該突變引起心肌纖維對C'+的敏感度增加,造成心肌收縮力增強和纖維舒張功能受損[21],R1呢H轉(zhuǎn)基因小鼠同樣呈RCM表型[22].
         在病例2中發(fā)現(xiàn)了TNN"基因新發(fā)雙缺失突變,該突變位于肌鈣蛋白T與原肌球蛋白結(jié)合功能區(qū),所在序列在多個物種高度保守.肌鈣蛋白T在結(jié)構(gòu)上分為3個功能區(qū)域——N端的選擇性剪切區(qū)、T1結(jié)構(gòu)域(第20~170號氨基酸,原肌球蛋白結(jié)合區(qū))、"結(jié)構(gòu)域(位于C端,第180~288號氨基酸).2006年P(guān)eddy等[7]報道在1例RCM患兒中發(fā)現(xiàn)了TNN"基因p%浼lE突變,隨后20Og年Kash等[4]報道在RCM患兒中發(fā)現(xiàn)E136K突變.p%delE和E136Κ突變均位于肌鈣蛋白T與原肌球蛋白結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域.
         Rnto等[23]研究發(fā)現(xiàn)TNN"基因突變導(dǎo)致心肌細胞Ca2+的敏感度增加和肌動球蛋白ATP酶活性下降,造成心肌收縮力增強和纖維舒張功能受損.有趣的是,對ρAsn100~αu101del突變功能研究顯示第100號氨基酸Asn單個缺失造成心肌細胞C'+的敏感度增加,心肌收縮力增強和纖維舒張功能受損,第101號氨基酸Glu單個缺失造成心肌細胞C'+的敏感度降低,而         pAsn100_Glu101浼l雙缺失整體效應(yīng)表現(xiàn)為心肌細胞Ca2+的敏感度增加,心肌收縮力增強和舒張功能受損[z].TNN"不同位置的氨基酸突變產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng),確切分子機制仍然不清楚,可能與突變導(dǎo)致心肌細胞C'+的敏感度及收縮功能改變、肌動球蛋白ATP酶活性改變等機制有關(guān).
         總之,我們報道的3例兒童原發(fā)性RCM均病情迅速進展,遺傳分析均發(fā)現(xiàn)了相關(guān)致病突變,顯示了較高的突變陽性率,進一步證實心肌肌節(jié)蛋白基因突變是兒童原發(fā)性心肌病的重要病因.對兒童原發(fā)性RCM進行肌節(jié)蛋白基因,尤其是TNNI3和TNN"基因突變檢測,對RCM的遺傳診斷有重要意義.
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