紫杉醇對SHI-1細胞株增殖抑制及凋亡的影響

近年來新技術(shù)、新的抑癌藥物不斷涌現(xiàn),但復(fù)發(fā)、難治性白血病的治療,仍然是個難題。紫杉醇作為一種新一代植物堿類抗腫瘤藥物,主要是通過作用于微管系統(tǒng)而抑制細胞分裂,被廣泛用于卵巢癌、乳腺癌、黑素癌、肺癌的治療?，F(xiàn)將本研究通過體外觀察紫杉醇對人急性單核細胞白血病細胞株sH⒈1的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及誘導(dǎo)分化的作用報道如下。
1 材料與方法
1.1 材料 SHI-1由蘇州大學(xué)附屬醫(yī)院、江蘇省血液研究所惠贈,紫杉醇為江蘇揚子江藥業(yè)集團產(chǎn)品;IMDM培養(yǎng)基為賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司產(chǎn)品,胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;DNA倍體分析試劑盒、異硫氰酸熒光黃(Annexin-V-FITC)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)細胞凋亡試劑盒、JC-1(5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。
1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將SHI-1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中,置37℃、飽和濕度、含5%C○2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2~3d更換培養(yǎng)液1次或根據(jù)培養(yǎng)液的顏色進行更換。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。
1.2.2 細胞活力和形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的細胞,以1×105/mL的細胞密度接種于24孔板中,每孔1mL,置37℃、5%C○2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再分別加人不同濃度的紫杉醇,使紫杉醇的終濃度分別為5、0.5、0,05、0.005mg/L組,同時設(shè)不加藥物的空白對照組。每組設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48h。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后,用0.4%臺盼藍直接染色2~10min,在顯微鏡下計數(shù)活細胞數(shù)。每次計數(shù)3次,實驗重復(fù)3次。細胞活率=[活細胞數(shù)/活細胞+死細胞數(shù)]×。取空白對照組和藥物作用后的各組細胞先在倒置顯微鏡下觀察,再將細胞懸液離心涂片,用瑞氏姬姆薩染色液染色,光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。
1.2.3 DNA倍體分析 取各組經(jīng)過藥物處理后的細胞懸液檢測DNA倍體。加入20uLPI染液,避光孵育30min后,上流式細胞儀檢測,分析后用ModRt軟件進行DNA倍體分析,計算出各期細胞的百分比。每組實驗重復(fù) 3次 。
1.2.4 AnncxinV/PI標(biāo)記染色測定凋亡細胞 取24孔板中的各組經(jīng)過藥物處理后的細胞懸液,采集1×106個細胞,用冷PBS液洗1遍后再0℃水浴,加人400uL結(jié)合緩沖液后,輕輕混勻細胞后加人5uL Annexin V-FITC和5uLPI液,避光孵育15min后,用流式細胞儀檢測。每組實驗重復(fù)3次,繪制時效曲線。
1.2.5 JC-1染色檢測細胞線粒體跨膜電位(△Ψm)將2×105/mL細胞懸液加人JC-1熒光染液5uL充分混勻,置37C、5%C02的培養(yǎng)箱中,避光孵育20min,離心去除上清液并用PBS液洗滌2次,流式細胞儀檢測,以BD公司FACSDiva軟件分析結(jié)果。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理,計量資料以x±s表示。組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下觀察紫杉醇誘導(dǎo)SHI-1細胞凋亡 倒置相差顯微鏡下,空白對照組SHI-1細胞呈梭形,形態(tài)均一,可成簇生長。較低濃度的紫杉醇藥物組可觀察到SHI-1細胞皺縮變小、胞體變圓,出現(xiàn)細胞碎片,未見細胞成簇生長。經(jīng)瑞氏姬姆薩染色油鏡下觀察,細胞形態(tài)出現(xiàn)核固縮、核邊聚、核碎裂,胞膜出泡,并可見典型的凋亡小體等。
2.2 細胞活力測定 紫杉醇作用于SHI-1細胞后,隨著作用劑量和時間的增加,細胞增殖率明顯受到抑制,細胞活率也顯著減少,呈現(xiàn)劑量和時間的量效關(guān)系(圖1)。
2.3 紫杉醇對SHI-1細胞凋亡的影響和對SHI-1線粒體跨膜點位(△Ψm)的影響 見表1~2。紫杉醇對SHI-1細胞周期的影響見圖2。
3 討論

紫杉醇是—種廣譜抗癌藥,對普通抗癌藥物耐藥的某些晚期腫瘤有良好的療效,對多種臨床惡性腫瘤療效顯著。近年來,隨著細胞凋亡研究的深人,人們已經(jīng)認識到抗腫瘤藥主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡發(fā)揮治療作用,能否誘導(dǎo)凋亡以及凋亡的程度已成為評價抗腫瘤藥物的重要指標(biāo)[l]。白血病的誘導(dǎo)分化和凋亡療法逐步成為白血病的兩個新治療策略[2]。有研究證實,紫杉醇抗腫瘤的機制之一是通過抑制細胞微管解聚,使細胞停滯在有絲分裂期,在G2/M期中發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)作用[3]。此外,還具有提高宿主細胞免疫力和誘導(dǎo)腫瘤壞死的作[4]。本研究中SHI-1細胞株是由蘇州大學(xué)附屬醫(yī)院、江蘇省血液研究所建立,建自一例臨床表現(xiàn)呈高度耐藥的急性單核細胞白血病患者,被證實對多種化療藥物耐藥[5]。有研究表明,以P糖蛋白(P-gP)為代表的某些三磷酸腺苷結(jié)合蛋白超家族成員以及某些轉(zhuǎn)運蛋白分子表達水平升高是很多化療藥物誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥的直接原因[6-7]。雖然已有體外實驗表明紫杉醇對白血病細胞株有增殖抑制作用[8-9],但尚未有人研究其治療難治性白血病的作用。
本研究結(jié)果表明,不同濃度的紫杉醇作用于SHI-1細胞株12、24、36、48h,細胞活力均有不同程度下降,以48h更為明顯。紫杉醇對細胞的生長具有明顯的抑制作用,其中,0.005mg/L組對SHI-1細胞株增殖抑制作用較弱,隨時間增加,其抑制率增大緩慢,0.05mg/L組對SHI-1細胞株增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用為顯著。本研究觀察到藥物濃度加大后,壞死細胞逐漸增多。因此,本研究認為,從凋亡的角度看誘導(dǎo)SHI-1細胞凋亡應(yīng)選擇適合的藥物濃度和作用時間,這樣可使正常細胞避免藥物過大劑量和超長的作用時間帶來的損害,任意提高藥物濃度和延長作用時間對誘導(dǎo)細胞凋亡是無益的[lO]。
根據(jù)紫杉醇臨床常規(guī)用藥的劑量范圍為135~175mg/m2,按文獻E11]的公式計算,其在體內(nèi)血漿中的濃度為89~1I6u釅mL,而本實驗所采用的紫杉醇濃度遠遠低于該水平。本研究發(fā)現(xiàn)低濃度紫杉醇較高濃度更易誘導(dǎo)細胞凋亡,對紫杉醇臨床治療劑量的制定具有一定的參考價值。若在臨床中使用紫杉醇治療難治性白血病,可從小劑量開始,其臨床療效及不良反應(yīng)有待進一步研究。
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