作者:曹同濤
【摘要】 目的 探討紫花茄皂苷I5對不同腫瘤細(xì)胞系的體外抗腫瘤作用。方法 用酸性磷酸酶(APA)法檢測紫花茄皂苷I5對不同部位人源性腫瘤細(xì)胞株體外生長的抑制作用。結(jié)果 紫花茄皂苷I5對所試腫瘤細(xì)胞株的體外生長皆具有一定的抑制作用,尤其是對人肝癌BEL7404、人鼻咽癌CNE和人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的生長抑制作用較強,抑制率可達到70%以上。結(jié)論 體外實驗表明紫花茄皂苷I5對4種不同部位人源性腫瘤細(xì)胞株皆具有一定的抗腫瘤細(xì)胞生長作用,敏感細(xì)胞株為肝癌和結(jié)腸癌細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】 皂苷 酸性磷酸酶法(APA) 抗腫瘤作用
【Abstract】 ob[x]jective To examine the inhibitory effects of saponin I5 in Solanum indicum L. on different tumor cell lines in vitro.Methods Acid phosphatase assay (APA) was adopted to detect the effects of saponin I5 on the growth of tumor cell lines in vitro.Results The solanum saponin had inhibitory effects on every tested tumor cell line.Especially, the growth inhibitory ratio of saponin I5 on the tested tumor cell lines(BEL7404, CNE and HT29)reached above 70%.Conclusion The solanum saponin I5 has inhibitory effects on the growth of tumor cell lines in vitro,and the most sensitive cell line to saponin I5 is hepatocarcinoma cell.
【Key words】 saponin, acid phosphatase assay(APA), antitumor effect
近年來隨著分離提取技術(shù)的不斷發(fā)展,多種薯蕷皂苷被分離出來,并不斷發(fā)現(xiàn)其新的生物活性,特別是在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降血脂、抗艾滋病等方面的作用引起了人們的重視[1,2],我們的前期研究結(jié)果已顯示合成紫花茄皂苷具有一定的抗腫瘤作用,對人源肝癌BEL7402細(xì)胞株的生長具有抑制作用,還可誘導(dǎo)BEL7402細(xì)胞的凋亡[3,4]。為了更好的認(rèn)識紫花茄皂苷I5的抗腫瘤譜,本研究采用4種不同部位人源性腫瘤細(xì)胞株對紫花茄皂苷I5進行體外抗腫瘤篩查,探討其體外抗腫瘤作用。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑及儀器 RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司,DHanks液、PBS緩沖液、0.1%EDTA溶液等均按常規(guī)配制[5,6],新生牛血清為黑龍江省同江市江海生物公司產(chǎn)品,二氧化碳培養(yǎng)箱(Hereus公司),96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為Nunc公司產(chǎn)品,EL311酶標(biāo)免疫檢測儀(BioTek公司),相差倒置顯微鏡(Olympus)。
1.1.2 細(xì)胞株 人肝癌BEL7404細(xì)胞系,引自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)系。人鼻咽癌CNE細(xì)胞系、人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞系、人大細(xì)胞肺癌NCIH460細(xì)胞系均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心。
1.2 方法
1.2.1 藥物及配制:紫花茄皂苷I5由中國科學(xué)院生態(tài)研究環(huán)境中心生物技術(shù)室提供。皂苷以二甲基亞砜(DMSO)溶解,加入細(xì)胞前用培養(yǎng)液稀釋至1~10 g/ml,其中DMSO高濃度為0.1%。陰性對照為0.1%DMSO的培養(yǎng)液。
1.2.2 酸性磷酸酶法(acid phosphatase assay, APA)[7]體外抗腫瘤譜篩選:取對數(shù)生長期細(xì)胞,消化后制成細(xì)胞懸液,按1×103/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后,實驗組加入先用DMSO溶解、再經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至終濃度為1~10 μg/ml的皂苷;空白對照組加入RPMI1640培養(yǎng)液;溶劑對照組加入經(jīng)同樣稀釋的溶劑,含0.01%~0.1%DMSO。實驗中每個濃度設(shè)8個平行孔,作用72 h后用APA法經(jīng)EL311酶聯(lián)免疫檢測儀在405 nm波長處測定吸光度OD值,空白孔調(diào)零,實驗重復(fù)三次,取平均值。按下列公式計算細(xì)胞生長抑制率:生長抑制率(%)=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗中每組設(shè)平行孔8個,結(jié)果用平均值表示。使用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件包分析統(tǒng)計學(xué)差異,方法采用單因素方差分析(OneWay ANOVA),P<0.05為差異具有顯著性。
2 結(jié)果
2.1 紫花茄皂苷I5作用后對腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響 4種不同部位人源性腫瘤細(xì)胞生長72 h后,光鏡下觀察,未給藥組細(xì)胞貼壁并呈梭形或多邊形生長,細(xì)胞數(shù)目多,鋪滿整個瓶底,細(xì)胞生長狀態(tài)較好。皂苷I5高劑量組細(xì)胞貼壁狀況不好,折光性較差,部分細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中,活細(xì)胞數(shù)目較對照組少。
2.2 紫花茄皂苷I5體外細(xì)胞抗腫瘤譜篩選 APA法原理是利用活細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶在酸性環(huán)境下分解磷酸酶底物硝基苯磷酸鹽,形成淡黃色的產(chǎn)物,用酶標(biāo)儀在405 nm處檢測吸光度。該方法可用于96孔板培養(yǎng)的各種細(xì)胞,十分簡便快捷,靈敏度高(可達100個細(xì)胞/孔)、重復(fù)性好[7]。
各腫瘤細(xì)胞株經(jīng)體外APA法檢測篩選,紫花茄皂苷I5對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率見表1。實驗結(jié)果表明,紫花茄皂苷I5敏感細(xì)胞系為人肝癌細(xì)胞株BEL7404、人鼻咽癌細(xì)胞株CNE和人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞,其大抑制率皆達到70%以上,而對人大細(xì)胞肺癌NCIH460細(xì)胞的有效濃度從6 μg/ml開始,大抑制率僅為50%左右。表1 紫花茄皂苷I5對不同腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制率 注:與空白對照相比, *P<0.05,△P<0.001
3 討論
大量研究結(jié)果表明,植物來源的抗腫瘤藥具有種類多、小、不良反應(yīng)少的特點。因此,從植物中尋找高效的抗腫瘤藥物已成為一種新的研究思路[8]。近年來國內(nèi)外學(xué)者也對皂苷類藥物的抗腫瘤作用及其作用機制進行了研究。Chiang等[9]證實從紫花茄中提取的薯蕷皂苷、甲基原皂苷、甲基原薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷對結(jié)腸癌Colo205、鼻咽癌KB、宮頸癌Hela腫瘤細(xì)胞株有殺傷作用。馬朋等[3]報道,合成紫花茄皂苷在體外可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞BEL7402凋亡。
本研究采用多種不同部位的人源性腫瘤細(xì)胞株對紫花茄皂苷I5的體外抗腫瘤作用進行系統(tǒng)觀察,探討其抗腫瘤作用及其可能的敏感腫瘤細(xì)胞株。篩選實驗發(fā)現(xiàn)紫花茄皂苷I5對所選用的肝癌細(xì)胞株BEL7404和結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29生長抑制作用較強,其大抑制率皆達到90%以上;對人鼻咽癌細(xì)胞株CNE敏感性其次,大抑制率為70%以上;而對NCIH460細(xì)胞的敏感性差,有效濃度從6 μg/ml開始,大抑制率僅為50%左右,從而提示對紫花茄皂苷I5較敏感的細(xì)胞株是肝癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞。由于肝癌是國內(nèi)發(fā)病率較高的一類腫瘤,結(jié)腸癌是發(fā)達國家發(fā)病率較高的一類腫瘤,我國的發(fā)病率也日趨升高,深入研究紫花茄皂苷的抗腫瘤作用,對醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展具有實用價值。有關(guān)紫花茄皂苷體內(nèi)藥效的驗證將有待于進一步的研究。
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