人腦膠質(zhì)瘤PTEN基因mRNA和蛋白的表達(dá)及其相關(guān)性分析

　【摘要】 目的 探討PTEN mRNA和蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義，并分析其相關(guān)性。方法 分別采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)和免疫組化(IHC)方法檢測(cè)PTEN在正常腦組織及不同組織學(xué)分級(jí)的人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況。結(jié)果 Kruskalwallis H檢驗(yàn)顯示，PTEN在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與正常腦組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高，PTEN表達(dá)強(qiáng)度逐漸下降。結(jié)論 PTEN表達(dá)的缺失可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中極其重要的環(huán)節(jié)，PTEN可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生以及其預(yù)后判斷的重要生物學(xué)指標(biāo)。
　　【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)瘤;PTEN;反轉(zhuǎn)錄PCR;免疫組織化學(xué)

　　Relationship between the ex[x]pression of PTEN mRNA

　　and protein in human brain glioma

　　MENG Xijun, LIU Yong, WANG MaoDe, XIE WanFu

　　(1. Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University; 2. Department of Anatomy and Histoembryology,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: ob[x]jective To explore the clinical significance of the differential ex[x]pression of PTEN in glioma tissue. Methods The mRNA and protein ex[x]pressions of PTEN were assayed by reverse transc[x]ription polymerase chain reaction (RTPCR) and immunohistochemistry in 75 human brain glioma cases. Results The positive ex[x]pression rate mRNA of PTEN differed significantly between brain glioma tissue and normal brain tissue (χ2=22.66, P<0.01); the ex[x]pression of PTEN was significantly higher in welldifferentiated glioma than in poorly differentiated glioma. Along with the increase of glioma malignancy level, the ex[x]pression intensity of PTEN decreased. Conclusion The decrease of the ex[x]pression of PTEN mRNA and protein may have a very important effect on development and growth of glioma. It could be helpful in predicting the biological behavior and prognosis of glioma.

　　KEY WORDS: glioma; PTEN; reverse transc[x]ription polymerase chain reaction (RTPCR); immunohistochemistry

　　腦膠質(zhì)瘤約占顱內(nèi)腫瘤總數(shù)的40%，是危害人類健康的常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤。該腫瘤呈惡性浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，且多生長(zhǎng)在腦部重要結(jié)構(gòu)，如基底節(jié)、中央溝區(qū)、丘腦、腦干等部位，是一種極具攻擊性的腦部腫瘤;同時(shí)其腫瘤細(xì)胞分化不一致,臨床上可表現(xiàn)為不同的膠質(zhì)瘤類型，呈現(xiàn)不同的生物學(xué)特性。因此，腦膠質(zhì)瘤不僅手術(shù)難以全切，而且術(shù)后易復(fù)發(fā)、預(yù)后差，臨床治愈十分困難。單純手術(shù)治療腦膠質(zhì)瘤的5年存活率<25%，而中、遠(yuǎn)期生存率主要受術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的困擾。因此，明確其發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制是提高腦膠質(zhì)瘤患者治療效果和降低死亡率的關(guān)鍵。第10號(hào)染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10, PTEN)是目前發(fā)現(xiàn)的個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，在多種組織中均有表達(dá)，其表達(dá)的異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[13]。本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)和免疫組化方法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)狀況，探討PTEN與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的關(guān)系。
　　1 材料與方法
　　1.1 標(biāo)本來(lái)源

　　收集我院神經(jīng)外科2007年6月至2008年6月間手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本75例。組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)15例，Ⅱ級(jí)22例，Ⅲ級(jí)23例，Ⅳ級(jí)15例。所有病例術(shù)前均未進(jìn)行任何化學(xué)和放射治療，術(shù)后均經(jīng)病理診斷證實(shí)。
　　1.2 主要試劑和儀器
　　RTPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;兔源性PTEN多克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品;免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。Eppendorf 5410離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品;9700 PE基因擴(kuò)增儀為美國(guó)PE公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)BioRAD公司產(chǎn)品。
　　1.3 RTPCR檢測(cè)PTEN mRNA的表達(dá)
　　擴(kuò)增引物根據(jù)PTEN參考序列NM_000314.4設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5′CTTTGTGCTGAAAGACATTATGAC3′，下游引物：5′GGCTTTGTCTTTATTTGCTTTGTC3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為792bp。以β肌動(dòng)蛋白(βactin)為內(nèi)參照，上游引物：5′ GTTTGAGACCTTCAACAACAC
　　CCC3′，下游引物：5′GTGGCCATCTCTCTTGCTCGAAGTC3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為320bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系25μL，擴(kuò)增條件為：94℃ 1min，94℃ 30s，55℃ 45s，94℃ 1min，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)，再72℃ 7min做終延伸。取PCR產(chǎn)物5μL，15g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外線燈下觀察電泳條帶并進(jìn)行分析。位于234bp和320bp上的條帶分別為PTEN和βactin mRNA的擴(kuò)增片段，如在234bp出現(xiàn)擴(kuò)增片段則判斷PTEN mRNA陽(yáng)性表達(dá)，否則為陰性。
　　1.4 免疫組織化學(xué)染色

　　腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本均經(jīng)100mL/L的甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～5μm。載玻片經(jīng)多聚賴氨酸處理，防止脫片。微波抗原修復(fù)。染色步驟按試劑盒說(shuō)明書操作。PTEN抗體稀釋濃度為1∶200。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，用已知PTEN陽(yáng)性的前列腺癌切片做陽(yáng)性對(duì)照。PTEN以腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。
　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5 for window統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。組間比較采用Kruskalwallis H檢驗(yàn)分析，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)為α=0.05。
　　2 結(jié)果

　　2.1 PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)

　　PTEN mRNA和蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1。Kruskalwallis H檢驗(yàn)可見(jiàn)，PTEN在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與正常腦組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)中意義(P<0.01)，且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高，PTEN表達(dá)強(qiáng)度逐漸下降。同樣方法分析小于5cm的膠質(zhì)瘤和大于5cm的膠質(zhì)瘤PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)情況，可以看出腫瘤的大小與PTEN的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(圖1、圖2)。表1 腦膠質(zhì)瘤PTEN基因mRNA和蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(略)

　　2.2 PTEN mRNA與PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性
　　經(jīng)Spearman檢驗(yàn)分析，PTEN mRNA的表達(dá)與PTEN蛋白的表達(dá)一致，即前者表達(dá)越強(qiáng)，后者表達(dá)也越強(qiáng)，兩者呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.99, P=0.0001)。
　　3 討 論
　　PTEN基因，又稱MMAC1或TEP1，定位于人染色體10q23.3，是1997年發(fā)現(xiàn)的一種與人類多種腫瘤惡性增殖與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的腫瘤抑制基因。PTEN具有蛋白酪氨酸磷酸酶及雙特異性磷酸酯酶活性，能對(duì)酪氨酸和絲(蘇)氨酸進(jìn)行去磷酸化作用，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的個(gè)具有磷酸酯酶活性的抑癌基因。據(jù)目前資料顯示,在多種腫瘤的發(fā)病中，PTEN基因改變主要有基因點(diǎn)突變和基因缺失，如拼接突變、移碼突變、無(wú)義突變、錯(cuò)義突變、小片段缺失和小片段插入等[4]，這些都會(huì)引起PTEN的蛋白表達(dá)下降，進(jìn)而使其對(duì)抗酪氨酸激酶的作用減小或消失，不能抑制細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基磷酸化。研究表明，磷酸化和去磷酸化是多種細(xì)胞基本活動(dòng)過(guò)程中起關(guān)鍵性作用的調(diào)節(jié)機(jī)制。PIP3作為細(xì)胞中的第二信使，是控制細(xì)胞生長(zhǎng)的主要角色，既能刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，又能阻止細(xì)胞凋亡。PTEN蛋白的磷酸酯酶能使PIP3位置3上的磷酸脫磷酸化，蛋白激酶B(PKB/AKT)的活性降低，抑制細(xì)胞周期G1～S期進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑,促使細(xì)胞凋亡發(fā)生[5]。PTEN表達(dá)的減少或缺失突變使基因喪失原有的功能,結(jié)果使細(xì)胞生長(zhǎng)失去控制。此外,PTEN通過(guò)蛋白性磷酸酯酶活性抑制FAK等的磷酸化,發(fā)揮抑制細(xì)胞的遷移、鋪展和粘附作用[6]。而PTEN表達(dá)的缺失將會(huì)導(dǎo)致FAK的磷酸化水平增高,可使腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)能力進(jìn)一步增強(qiáng)從而不能阻斷細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)信息傳遞,導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞不斷分裂增殖,進(jìn)而形成膠質(zhì)瘤[78]。本研究我們通過(guò)收集的75份腦膠質(zhì)瘤病理組織，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平研究了PTEN基因在不同分級(jí)的腦膠質(zhì)瘤組織中PTEN的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Ⅰ～Ⅳ腦膠質(zhì)瘤組織中PTEN的mRNA表達(dá)率分別為80%、59.1%、39.1%和33.3%;蛋白的表達(dá)率分別為80%、54.5%、39.1%和33.3%。通過(guò)Kruskalwallis H檢驗(yàn)分析，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此推測(cè)，PTEN表達(dá)的改變不但是腫瘤發(fā)生過(guò)程中的早期事件，而且隨著組織學(xué)分級(jí)的升高，PTEN的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明PTEN的表達(dá)隨膠質(zhì)瘤組織惡性程度的變化而改變，即膠質(zhì)瘤組織學(xué)分級(jí)越高其表達(dá)水平越低。提示該基因與膠質(zhì)瘤的演化及侵襲進(jìn)程關(guān)系密切，PTEN表達(dá)下調(diào)的腦膠質(zhì)瘤更具有惡性表型和惡性行為。
　　綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)水平的研究，證實(shí)了PTEN表達(dá)的缺失可能是腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中極其重要的環(huán)節(jié)，它可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生以及其預(yù)后判斷的重要生物學(xué)指標(biāo)。這對(duì)今后腦膠質(zhì)瘤的檢測(cè)和防治具有一定的指導(dǎo)作用。
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