骨髓腔內注射造血干細胞移植的研究和應用進展

作者：蔡耘,黃紹良　　作者單位：中山大學附屬第二醫(yī)院兒科，廣州 510120

　　【摘要】骨髓腔內注射造血干細胞移植旨在促進HSC的歸巢。近年來已有大量的動物實驗肯定了不同來源供體細胞通過骨髓腔內注射能有效地歸巢并植入骨髓、迅速重建受體造血和免疫功能、減少GVHD，誘導同種異基因器官移植免疫耐受，提高受體生存率。本文主要對該技術在骨髓移植、臍血移植、研究HSC生物學特性等方面的作用以及臨床應用前景進行綜述。

　　【關鍵詞】 骨髓腔內注射

　　Abstract The purpose of hematopoietic stem cell transplantation by intra-bone marrow injection (IBM-HSCT) is to facilitate the homing of HSC. It has been recently proven in many animal experiments that different kinds of donor cells could efficiently home and engraft into the bone marrow by IBM-HSCT，which led to the rapid hemopoietic and immune recovery of recipients，preventing the development of GVHD，inducing the donor-specific tolerance in allogeneic organ transplantation，and promoting the survival rate of recipients. In this review，the effect of IBM-BMT and IBM-UCBT，the application of IBM injection technique in the study on HSC′ s biological characteristics，and its prospect for clinical HSCT were sumarized.

　　Key words intra-bone marrow injection;hematopoietic stem cell transplantation;bone marrow transplantation;cord blood transplantation

　　造血干細胞移植 ( hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)經過40余年的臨床應用，已成為能夠治愈血液病、實體瘤、遺傳代謝性疾病、自身免疫性疾病等多種疾患的安全有效的治療手段，其進一步發(fā)展尚依賴于諸多因素，如探索HSC的佳來源和輸注途徑，對HSC及其相關細胞因子生物學特性的進一步研究，預處理方案的優(yōu)化以及對移植相關并發(fā)癥的預防和處理等等。新的理論和移植技術層出不窮，其中旨在促進HSC歸巢的骨髓腔內注射(intra-bone marrow injection，IBMI)技術，自2001年Kushida等[1]提出后，隨著動物實驗有效性的報道不斷增多，已向我們展示出它對HSCT的重要作用和廣闊的臨床應用前景。

　　經外周靜脈輸注HSC的歸巢以及

　　對HSCT的影響傳統(tǒng)HSC輸入途徑為經外周靜脈輸注，該技術已廣泛應用于臨床HSCT與相關基礎研究中。以此法輸注的HSC須先經右心房、右心室、肺部進入體循環(huán)，在4小時內根據血流量的不同進入骨髓、肝、脾、肺、骨骼肌及其它組織中，但絕大部分滯留于肺部，僅有少量HSC能在某些細胞因子(如SDF-1及其受體CXCR4等)的影響下識別相應的血管位點并穿越基底層到達骨髓腔。這一特異且迅速的過程稱為HSC“歸巢”(homing)，一般在移植后12-36小時內完成。只有歸巢并定居于骨髓微環(huán)境中合適“龕位”(niche)的HSC才能進一步增殖、分化和重建造血[2]。有研究發(fā)現移植后3小時僅有(5.6±0.7)%的供體細胞到達骨髓腔[3]。Yahata等[2]將PKH-26標記的人臍血CD34+細胞經尾靜脈輸入經60Co亞致死量照射后的NOD/SCID小鼠，發(fā)現移植后20小時受體骨髓腔中的供體細胞只占其骨髓細胞總數的 (1.56 ± 0.32)%。 經外周靜脈輸注的HSC如此低的歸巢比例無疑將明顯影響其植入效率。由van-der-Loo等[4]所進行的小鼠同種異基因 HSCT中，骨髓和脾臟的種植效率分別為18% -20%和8% -10%。在異種移植中該比例更低，據Cashman等[5]報道，人臍血HSC植入亞致死量輻照的NOD/SCID小鼠的效率為7%。

　　中國實驗血液學雜志 J Exp Hematol 2006;14(1)骨髓腔內注射造血干細胞移植的研究和應用進展為減少HSC在受體骨髓外器官組織的滯留而造成的損失，國內外學者曾嘗試HSC的其他注射途徑。如劉英等[6]將人臍血MNC直接注入胚胎卵黃囊內進行SD大鼠宮內移植，植入率為89.7%，未發(fā)生GVHD。這一結果提示胚胎對異體抗原的反應表現為免疫耐受，外源性HSC卵黃囊內移植能更早地與受體HSC競爭，產生更高的嵌合比例;Fan等[7]發(fā)現，經門靜脈注射(portal vein injection，PV injection)的HSC在7天內遷移至造血、免疫器官，移植后第3天和第7天肝臟、骨髓和胸腺中供體源細胞明顯高于尾靜脈注射組(i.v組)。PV組67%的小鼠可存活40天以上，i.v組小鼠則在23天內全部死亡，提示HSCT門靜脈注射途徑可有效地重建造血和免疫，提高受體存活率。顯然以上方法都因技術操作難度大、設備條件限制不易于臨床的應用和推廣。近年來的動物實驗研究提示，具有較長臨床應用歷史的骨髓腔內輸注技術可能是一種安全、有效的HSC輸注手段。

　　骨髓腔內輸注的理論基礎與臨床應用

　　位于長骨骨髓腔和扁骨松質骨骨小梁中的骨髓含有豐富的血管，某些小血管的管壁變薄、管腔擴大成為血竇，骨髓腔內充滿網狀的海綿狀靜脈竇。長骨和扁骨骨髓腔中的靜脈竇匯集成一至數條大的靜脈沿動脈徑路出骨后匯入靜脈干。骨髓腔內靜脈竇一定程度的開放狀態(tài)和高通透性是骨內輸液的解剖學基礎，控制輸注速度和濃度既能提高局部藥物濃度又能使輸入的藥物和液體有效地進入全身血液循環(huán)，成人輸液速度可達20 -50 ml / min。骨穿刺部位宜選四肢長骨尤其是脛骨近端，骨質較硬者可采用脛骨中部稍上方處。髂骨、胸骨、鎖骨均不如四肢長骨操作方便和成功率高。并發(fā)癥少見，多為液體滲漏皮下或骨膜下、繼發(fā)感染、骨筋膜室綜合征、脂肪栓塞等[8]。

　　由于靜脈輸液導管類型和質量的改進，20世紀40年代后期骨髓腔輸液已很少用于常規(guī)治療，而多用于急癥搶救時建立輸液通路和某些疾病的特殊治療。傅美珍等[9]單用超小劑量阿糖胞苷(8-10毫克/次，每周1次)骨髓腔內注射治療2例成人急性非淋巴細胞白血病(M2型)，分別于51天、57天獲得完全緩解。Sesay等[10]在脊椎整形術中以利多卡因椎骨腔注射聯合納布啡、丙帕他莫靜脈推注，麻醉有效率與單純靜脈用藥組相當(85 % vs 84%)，但副作用的發(fā)生率少75%，利多卡因血漿濃度僅為中毒劑量的1/4。還有骨髓腔內用藥成功治療再生障礙性貧血、創(chuàng)傷性骨髓炎等疾病的報道，但至今尚無骨髓腔內注射HSCT的臨床研究資料。

　　骨髓腔內注射HSCT的實驗研究現狀

　　骨髓腔內注射HSCT的直接目的是增加HSC的歸巢。但已有研究證實，經骨髓腔內輸注的藥物可迅速地彌漫到靜脈竇，從骨髓到動脈與從靜脈到動脈的循環(huán)時間一致。但直接注射入骨髓腔中的HSC是否能及時、有效地植入“龕位(niche)"并增殖分化、重建受體造血免疫功能，IBM輸注途徑對受體免疫功能的恢復及GVHD有何影響，鑒于骨髓腔穿刺可能增加病人的痛苦和繼發(fā)感染的機會，該方法是否有肯定的臨床應用價值等問題都需要深入探討。目前對這一技術的研究成果主要是在動物實驗的基礎上改進和完善其具體操作方法，并已通過一系列的動物模型驗證其有效性。

　　骨髓腔內注射骨髓移植(IBMI-BMT)

　　雖然IBMI在臨床上是非常成熟、安全的技術，但對于實驗動物，尤其是嚙齒類小動物則不易操作，從而限制了對此技術的深入研究。近年來，日本關西醫(yī)科大學Ikehara領導的研究小組對動物骨髓液的采集、IBMI的方法做了部分改進，其可操作性大為提高。Ikehara小組以長骨灌流法(perfusion me- thod)采集骨髓，IBMI則以受鼠長骨(如脛骨、股骨)為穿刺部位，行約5 mm皮膚切口，持50 μl或1 ml微量注射器以26-29 G針頭自膝關節(jié)表面穿過膝腱插入骨髓腔。每只受鼠注射供體細胞數為5×106-3×107 BMC，注射液容量為3.5-40微升/每側脛骨腔。Ikehara小組已建立了小鼠、大鼠、家兔及食蟹猴等多種移植動物模型。

　　現有研究資料表明，IBMI-BMT單獨或與其它方法聯合運用能明顯提高供體細胞植入效率，促進受體造血、免疫功能的重建。Kushida等[1]應用IBMI技術，以正常C57BL/6小鼠為供體對狼瘡性腎炎MRL/lpr小鼠行異基因骨髓移植，發(fā)現IBMI組移植后3天供體源性骨髓細胞在受體注射側及非注射側脛骨骨髓中均占60%，脾臟中占40%，移植后10天在上述部位幾乎達到，而i.v組移植后3天供體源性細胞在骨髓中<10%，移植后10天為70%。IBMI組所有受鼠的無病生存期超過1年，原有的異常T細胞(Thy1.2+/B220+/CD4-/CD8-)消失，混合淋巴細胞培養(yǎng)及抗綿羊紅細胞抗體生成實驗證實受體具有正常的免疫功能;2004年Nakamura等[11]報道，將骨髓腔內注射細胞濃度提高至5×106/3.5 μl，行雙側脛骨注射并聯合供體外周血單個核細胞(PBMNC)靜脈輸注(DLI)，平均于BMT后7天植入并成為完全供體型，受鼠達到長期存活(>120天);Zhang等[12]則進一步比較骨髓造血細胞聯合基質細胞骨髓腔內輸注或靜脈輸注及單純骨髓造血細胞骨髓腔內輸注的移植效果，發(fā)現兩種細胞同時骨髓腔內注射可以更好地促進供體細胞在受體內的造血、免疫重建。

　　在實質器官移植中，IBMI-BMT亦起到良好的誘導免疫耐受的作用。Esumi等[13]將受體BN大鼠予氟達拉賓+亞致死量60Co輻照預處理，24小時后移植F344大鼠后肢并接受其骨髓細胞IBMI。在不予免疫抑制劑的情況下觀察一年，全部受鼠存活，移植肢體均未出現排斥反應，而且供體細胞能完全重建造血。

　　Ikehara[14]認為IBMI-BMT有以下優(yōu)勢：①GVHD罕見，即使供體細胞中含有一定量的T細胞(<6%)亦無GVHD發(fā)生;②植入率高，即使預處理照射劑量低于亞致死量也可移植成功;③造血重建快;④T細胞的功能可以完全恢復。IBMI-BMT的有效性與其促進骨髓HSC與基質細胞的歸巢密切相關：①經骨髓腔注射的HSC可在注射及非注射部位的骨髓和其它造血器官中迅速達到佳的分布。② IBMI-BMT可以有效地使供體骨髓基質細胞進入受體受損的骨髓微環(huán)境中支持造血。同時這些基質細胞可通過直接包繞HSC或分泌具免疫抑制作用的肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子β(TGF-β)等細胞因子使HSC免受免疫活性細胞的攻擊，還可經血循環(huán)進入胸腺參與T細胞的陽性選擇而促進T細胞免疫功能的恢復。③灌流法(PM)能避免傳統(tǒng)髂骨多點穿刺抽取法所造成的外周血(如CD4+、CD8+T淋巴細胞)混入，因此減少甚至避免了GVHD的發(fā)生，而PM法采集的HSC活性亦高于傳統(tǒng)方法。

　　骨髓腔內注射臍血移植(IBMI-UCBT)

　　臍血移植(UCB transplantation，UCBT)已經成為可替代BM-HSCT的重要治療手段。但由于單份UCB所含HSC數量有限并更為幼稚，免疫效應細胞功能不成熟，以致UCBT后造血、免疫重建延遲，感染率、移植相關死亡率較高，在一定程度上影響和限制了UCBT的發(fā)展應用。有希望解決UCBT造血恢復延遲的策略包括通過體外擴增、混合臍血移植等方法增加UCB中HSC的數量，以間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)與造血干細胞聯合移植以促進供體HSC歸巢骨髓并迅速增殖等。其中，促進UCB中有限的HSC歸巢并植入骨髓是目前研究的熱點之一。

　　已有動物實驗證實IBMI-UCBT同樣能促進HSC歸巢，提高植入效率。Wang等[15]將人臍血CD34+細胞2×104-2×105/40 μl注入NOD/SCID小鼠脛骨骨髓腔中并做限制性稀釋法分析供體細胞的植入頻率，發(fā)現IBM組人臍血Lin-/low CD34+CD38-細胞的植入頻率為1/44，而i.v組僅為1/660。移植后在外周血、脾臟及非注射側脛骨骨髓腔內均檢出該供體細胞并能夠分化，提示骨髓內移植有正常的歸巢和種植機制。取出移植后6周的小鼠骨髓內人CD45+細胞進行第2次靜脈或骨髓內注射，IBMI組與i.v組的供體嵌和比例分別為0.546±0.268 、0.031±0.018(P<0.01);

　　Castello等[16]報道，將IBMI組輸注的人臍血細胞數減少1/2，于移植后30、60、90天與i.v組比較受體內人CD45+細胞和CD45+/CD34+細胞含量，兩組無明顯差異?？梢奍BMI法具有更高的移植效率，尤其在UCBT輸注細胞數有限的情況下更具有應用價值。

　　對于其它來源的HSC，如小鼠胚胎干細胞R1誘導分化的HSC，骨髓腔內注射亦較靜脈輸注有明顯的優(yōu)勢。

　　骨髓腔內注射在HSC生物學特性研究中的作用

　　IBMI技術除了可應用于不同來源造血干細胞移植實驗，還可廣泛用于有關HSC的基礎研究。例如CD34- HSC由于歸巢相關受體表達水平較低而缺乏SDF-1/CXCR4介導的歸巢能力，以傳統(tǒng)靜脈輸注途徑移植無法重建受體的造血免疫功能，因此難以研究其生物學特性。為排除歸巢的影響，Kimura等[17]將人臍血Lin-CD34-細胞直接注射入經60Co亞致死量照射的NOD/SCID鼠脛骨骨髓腔中，可使供體細胞成功植入。與CD34+細胞相比，該群細胞在受體內的分化、造血重建雖較遲緩，但具更高的增殖和遷移潛能，屬于原始的HSC，有更好的同質性(homogenous nature);Zhong等[18]則以股骨骨髓腔內注射的方法比較供體骨髓細胞在清髓或非清髓受鼠體內的再分布和增殖情況，結果顯示預處理方式對移植細胞的骨髓內再分布無明顯影響，供體細胞在非清髓受體中植入率低的主要原因是無法有效擴增，而不僅僅是“龕位”的缺乏。

　　骨髓腔內注射HSCT的臨床應用前景

　　以上的動物實驗驗證了骨髓腔內注射能夠通過促進HSC迅速有效的歸巢和植入骨髓來提高HSC的移植效率，因而有可能應用于臨床HSCT。但有關于IBM-HSCT的臨床研究資料卻極少。1998年Hagglund等[19]曾報道38例(年齡≥18歲)接受HLA全相合或1個位點不合的血緣相關骨髓移植，骨髓腔滴注(IBM-drop infusion，IBM-drop)、i.v+IBM-drop和i.v組分別有8、10、20例，結果ANC≥0.5×109中位時間分別是20、19、18.5天，IBM-drop組依賴靜脈營養(yǎng)和使用抗生素的時間明顯少于i.v組，而3組病例在急性和慢性GVHD發(fā)病率、移植相關死亡率、復發(fā)率及生存率方面無明顯差異。2003年Ikehara等[14]對此結果進行回顧分析，認為除了骨髓采集方法的影響外，Hagglund等[19]采用的髂骨骨髓腔滴注法容易使供體細胞過快地進入外周血循環(huán)而不是停留于骨髓內，因此不能達到佳的注射效果。而目前的研究仍缺乏從臨床角度探討骨髓腔內注射的佳治療策略，如注射劑量、部位、速度等。

　　綜上所述，大量的動物實驗肯定了不同來源供體細胞通過骨髓腔內注射途徑能有效地歸巢并植入骨髓，達到迅速重建受體造血和免疫功能，減少GVHD，誘導同種異基因器官移植免疫耐受，提高受體生存率的目的。這一技術值得進一步進入臨床移植研究和深入探討。

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