作者:黃曉兵,劉霆,孟文彤,智偉 作者單位:四川大學(xué)華西醫(yī)院血液科,血液病研究室, 1干細(xì)胞與組織工程實驗室,成都 610041
【摘要】本研究利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞構(gòu)建二維培養(yǎng)體系,探討其體外支持臍血干/祖細(xì)胞生存的作用。體外進(jìn)行人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)原代培養(yǎng)后誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞,構(gòu)建二維培養(yǎng)體系。將免疫磁珠分選的CD34+臍血干/祖細(xì)胞接種于其中,在無外源性細(xì)胞因子情況下進(jìn)行體外培養(yǎng),進(jìn)行CFU,HPP-CFU和LTC-IC測定并將其分別與MSC、成骨細(xì)胞,MSC/成骨細(xì)胞(1∶2)作為飼養(yǎng)細(xì)胞的二維培養(yǎng)體系實驗結(jié)果相比較。 結(jié)果發(fā)現(xiàn):在所構(gòu)建的造血干/祖細(xì)胞(HSPC)二維培養(yǎng)體系中,骨髓MSC誘導(dǎo)成骨細(xì)胞對于臍血造血干/祖細(xì)胞培養(yǎng)的支持作用顯著優(yōu)于其他各組培養(yǎng)體系,尤其對長期造血干細(xì)胞(long term-HSC)體外生存有更為明顯地支持作用。結(jié)論:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞構(gòu)建的二維體系對于臍血干/祖細(xì)胞體外培養(yǎng)具有支持作用,進(jìn)一步證實成骨細(xì)胞對造血干細(xì)胞生存與增殖具有重要調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
Abstract This study was aimed to construct a two-demensional culture system by using osteoblasts induced from human marrow mesenchymal stem cells (MSC) and to investigate its support effect on survival of hematopoietic stem/progenitor cells for umbilical cord blood (UCB) ex vivo. MSCs were isolated from adult human bone marrow and were cultured,the second generation of MSCs were induced into osteoblasts which were irradiated with 20 Gy gamma rays in a Cobalt 60 source and confluenced into a feeder la[x]yer. CD34+ cells were selected from fresh umbilical cord blood samples by using Microbead Kit of MiniMACS and seeded into the two-dimensional culture system to culture ex vivo without exogenous cytokines. By using colony-forming assay,high proliferative potential colony-forming cell assay,and long-term culture initiating cell assay,the ability of the two-dimensional system to culture HSCs/HPCs was observed. The results showed that the osteoblasts induced from bone marrow MSC in constructed two-demensional culture system displayed more significant support effect on survival of hematopoietic stem/progenitor cells from umbilical cord blood (UCB) ex vivo,compared with other culture systems,especially on long term HSCs survival ex vivo. It is concluded that the two-dimensional culture system constituted by osteoblasts induced from human MSCs has certain ability of supporting maintenance and multipotency of HSCs/HPCs from umbilical cord blood in vitro,especially sustaining survival of HSC in long-term culture. It has also been proved that osteoblasts play a crucial role in regulation of HSC growth.
Key words marrow mesenchymal stem cell; osteoblast; hematopoietic stem/progenitor cell; two-dimensional culture system; cord blood
長期以來,造血微環(huán)境被認(rèn)為只是由網(wǎng)狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血竇內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成。近年來的研究充分證明,骨髓中成骨細(xì)胞是構(gòu)成造血生態(tài)位區(qū)的主要成分,對于造血干/祖細(xì)胞的生存、增殖和分化起著關(guān)鍵性調(diào)控作用[1-5]。我們以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)建的二維培養(yǎng)體系,在無外源性細(xì)胞因子情況下,對臍血造血干/祖細(xì)胞(HSPC)的體外支持作用進(jìn)行了初步探討。
材料和方法
實驗分組
共分為4組:A組為MSCs細(xì)胞層+HSC;B組為成骨細(xì)胞層+HSC;C組為MSC/成骨細(xì)胞層+HSC;D組為MSC誘導(dǎo)成骨細(xì)胞層+ HSC。實驗中細(xì)胞層平鋪于12孔板中,每組接種6個孔。設(shè)定接種HSC后第1、3周為觀測點。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)體外培養(yǎng)和鑒定
在無菌條件下,從健康自愿者(35-40歲)髂后上棘穿刺,抗凝抽取骨髓15 ml,按參考文獻(xiàn)[6,7]進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。對MSC采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測CD29,CD44,CD45等細(xì)胞表型(試劑購自Becton Dickinson公司)進(jìn)行鑒定。
MSC誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞及其鑒定
MSC誘導(dǎo)分化
將第三代MSC以1×104/cm密度接種在75 cm塑料培養(yǎng)瓶和24孔板(內(nèi)含預(yù)處理的小玻片)中,仍給予DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng),48小時換液后,培養(yǎng)液換DMEM完全培養(yǎng)基 + 地塞米松10-8mol/L + 抗壞血酸50 μg/ml + β-甘油磷酸鈉10 mmol/L + bFGF 5 ng/ml,每2天換液1次(地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、bFGF購自晶美公司)。
誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞鑒定
① ALP檢測: 95%酒精固定15分鐘,采用鈷-鈣法染色;② I型膠原蛋白檢測: 10%中性福爾馬林溶液固定30分鐘,做免疫組織化學(xué)FITC標(biāo)記;③ 骨鈣素檢測: 4%多聚甲醛固定30分鐘,做免疫組織化學(xué)羅丹明標(biāo)記;④ 誘導(dǎo)鈣結(jié)節(jié)的生成,誘導(dǎo)后第21天茜素紅染色。
人同種異體成骨細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
取意外流產(chǎn)死胎(由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院提供,遵循自愿和知情同意原則,符合醫(yī)學(xué)倫理的有關(guān)要求)頭蓋骨骨膜,參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行成骨細(xì)胞原代培養(yǎng),并連續(xù)傳2-3代。成骨細(xì)胞的鑒定同上。
二維培養(yǎng)體系的建立
A、B、C、D組中,利用胰蛋白酶消化,用DMEM培養(yǎng)液將MSC、成骨細(xì)胞,MSC/成骨細(xì)胞(1∶2)和MSC誘導(dǎo)的成骨樣細(xì)胞制成5×104/ml的細(xì)胞懸液,鈷60照射(20 Gy)后,接種在12孔板上,每組6個孔。A組加入DMEM完全培養(yǎng)液,B組加入F12完全培養(yǎng)液,C和D組加入DMEM/F12培養(yǎng)液,每3天換液1次。
人臍帶血造血干/祖細(xì)胞分離、純化和接種
采用足月分娩死胎兒的臍血(由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院提供,符合醫(yī)學(xué)倫理的有關(guān)要求,遵循自愿和知情同意原則)。Percoll液(比重1.077)密度梯度離心后免疫磁珠分離(CD34+細(xì)胞單克隆抗體免疫磁珠分離系統(tǒng)購自Miltenti Biotech公司)。收集CD34+細(xì)胞;用流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD34+的純度。
將分離純化的臍帶血異基因HSPC加入髓系完全培養(yǎng)液(購自R&D公司),以1.8×105/ml 直接接種于A、B、C、D組各孔飼養(yǎng)層上,在37℃、5% CO2 、飽和濕度條件下培養(yǎng),每周半換液2次。
HSC接種后第1周、第3周,收集各組培養(yǎng)體系中細(xì)胞。A、B、C、D組首先通過輕輕沖洗,收集未黏附細(xì)胞,然后加入非胰蛋白酶細(xì)胞分離液(CDS購自Invitrogen公司),37℃孵育10分鐘再收集細(xì)胞,將各組收集的細(xì)胞臺盼藍(lán)拒染實驗并計數(shù)。
各組培養(yǎng)體系支持HSC/HPC的觀察
顯微鏡觀察 倒置顯微鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞的形態(tài)以及由以上細(xì)胞所構(gòu)建的二維培養(yǎng)體系情況。
臍血造血干細(xì)胞CFU和HPP-CFU實驗
臍血CD34+細(xì)胞接種培養(yǎng)1周,3周后,進(jìn)行造血祖細(xì)胞集落分析(CFU和HPP-CFU),以反映晚期和早期HPC的增殖和分化。采用甲基纖維素完全培養(yǎng)基(甲基纖維素-IMDM 1.3%,胎牛血清25%,牛血清白蛋白1%,L-谷氨酰胺2 mmol/L,2-巰基乙醇5×10-5mol/L;加人重組細(xì)胞因子SCF 50 ng/ml,GM-CSF 10 ng/ml,IL-3 10 ng/ml,EPO 3 U/ml購自Stem Cell公司),均勻與每孔消化下來的細(xì)胞混合,接種于12孔培養(yǎng)板中,每孔1.5 ml,復(fù)種2孔。置于5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28天,第14、第21天計數(shù)CFU-GM,BFU-E,CFU-GEMM。第28天計數(shù)HPP-CFU(直徑0.5 mm,細(xì)胞數(shù)50 000的高密度大集落)。
臍血造血干細(xì)胞的LTC-IC實驗
培養(yǎng)1周,3周后進(jìn)行LTC-IC分析,以反映HSC和早期HPC的增殖情況。用于該分析的滋養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞為受20 Gy照射的正常人骨髓基質(zhì)細(xì)胞,搜集每孔消化下來的細(xì)胞與Dexter長期骨髓培養(yǎng)液混合,接種于已鋪被基質(zhì)細(xì)胞層的12孔板,2 ml/well,每周半量換液1次,培養(yǎng)5-8周后用2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化,收集的細(xì)胞洗滌1次,按上述作集落培養(yǎng),第14天計數(shù)所有集落,即為LTC-IC。微量移液槍吸取1個集落涂片后Wright-Giemsa染色。
統(tǒng)計學(xué)處理
應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)用x±SD軟件進(jìn)行表示,兩組間比較采用t檢驗。當(dāng)P<0.05時,差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果
人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨膜成骨細(xì)胞培養(yǎng)
根據(jù)文獻(xiàn)方法分別進(jìn)行了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨膜成骨細(xì)胞原代培養(yǎng),結(jié)果細(xì)胞呈克隆樣生長。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)的MSC和osteoblast的形態(tài)見圖1。
人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞
當(dāng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳至第2或3代時,將部分細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)。誘導(dǎo)第8天時鈣-鈷法染色測ALP,可見85%細(xì)胞胞漿中有大量灰褐色顆粒;誘導(dǎo)第10天 I型膠原蛋白免疫組織化學(xué)FITC標(biāo)記,可見70%細(xì)胞漿不同程度的表達(dá)綠色熒光;誘導(dǎo)第14天骨鈣素免疫組織化學(xué)羅丹明標(biāo)記,可見80%細(xì)胞漿不同程度的表達(dá)紅色熒光;誘導(dǎo)第21天茜素紅染色可見在細(xì)胞聚集的部位出現(xiàn)紅色鈣結(jié)節(jié)(圖2)。
二維培養(yǎng)體系的建立及臍血造血干細(xì)胞接種
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞接種在孔板后第7天,利用倒置顯微鏡觀察二維培養(yǎng)體系的生長情況。臍血通過MiniMACS免疫磁珠陽性分選獲得CD34+細(xì)胞,流式細(xì)胞檢測其純度達(dá)80%。接種于二維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。培養(yǎng)1周和3周的成骨細(xì)胞見圖3。
培養(yǎng)1周后造血祖細(xì)胞集落與LTC-IC分析
無外源性細(xì)胞因子作用下,臍血造血干細(xì)胞在二維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)7天后,進(jìn)行造血祖細(xì)胞集落實驗。各組間的CFU-C和HPP-CFC比較無顯著性差異(P>0.05);而D組LTC-IC與其他各組間比較差異顯著(P<0.05)(表1,圖4、5)。
培養(yǎng)3周后造血祖細(xì)胞集落與LTC-IC分析
無外源性細(xì)胞因子作用下,臍血干細(xì)胞在二維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)21天后,進(jìn)行造血祖細(xì)胞集落實驗。比較各組CFU-C可見,D組較其他3組有顯著差異(P<0.05);比較各組HPP-CFC,結(jié)果B組、D組與其他組間的差異顯著(P<0.05);比較各組LTC-IC,結(jié) 果D組較其他3組有顯著差異(P<0.05)。 用微量移液槍吸取一個LTC-IC集落并進(jìn)行Wright-Giemsa染色,觀察到有向紅系和粒系等多向分化(表2,圖 6、7、8)。Table 1. CFU-C,HPP-CFC and LTC-IC colony-formation in A,B,C,D groups after 7 days (略)Table 2. CFU-C,HPP-CFC and LTC-IC colony-formation in A,B,C,D groups after 21 days (略)
討論
造血生態(tài)位區(qū)(hematopoietic niche)是由骨髓內(nèi)能容納一個或更多的造血干細(xì)胞、并調(diào)控其自我更新和分化的組織細(xì)胞亞群和細(xì)胞外物質(zhì)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)單位[8]。成骨細(xì)胞是造血生態(tài)位區(qū)的主要構(gòu)成成分,并對HSC的生存、增殖和分化起著關(guān)鍵性調(diào)控作用。這種作用主要表現(xiàn)在:胚胎發(fā)育晚期,成骨細(xì)胞成熟障礙將導(dǎo)致骨髓造血的缺乏;成骨細(xì)胞可以表達(dá)許多與造血調(diào)控相關(guān)的細(xì)胞因子,如G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-6、IL-7、LIF、TNF、VEGF等;成骨細(xì)胞的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)受體IA參與造血調(diào)控的信號傳導(dǎo)通路;成骨細(xì)胞通過分泌Notch配體Jagged1,活化HSC 中Notch1信號通路,促進(jìn)HSC的增殖。外源性PTH通過成骨細(xì)胞的甲狀旁腺激素(PTH)受體(PPR)引起成骨細(xì)胞增殖,相應(yīng)的HSC數(shù)目增多; 骨髓成骨細(xì)胞可募集宿主循環(huán)中的HSC,促進(jìn)歸巢,重建造血,同時HSC促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌IL-6,MIP 和其他因子,有助于HSC移植后微環(huán)境的形成。 在動物模型中,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)阻礙成骨細(xì)胞的發(fā)育成熟,則相應(yīng)骨髓造血也受到抑制。在小鼠異基因HSC移植實驗中,供者小鼠的成骨細(xì)胞聯(lián)合輸注,可明顯減少GVHD的發(fā)生,有助于受者小鼠的長期存活。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也是構(gòu)成造血生態(tài)位區(qū)的重要成分,這不僅因為它可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等其他構(gòu)成造血微環(huán)境的細(xì)胞成分,而且它本身也對造血干細(xì)胞的增殖分化進(jìn)行調(diào)控 [8-12] 。本研究采用地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)MSC向成骨細(xì)胞分化,利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞在體外構(gòu)建造血干細(xì)胞二維培養(yǎng)體系,在無外源性細(xì)胞因子的參與下,由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨膜成骨細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞等飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的相關(guān)因子,支持了臍血干/祖細(xì)胞體外培養(yǎng)[14],同時避免了外源性細(xì)胞因子促進(jìn)造血干細(xì)胞分化作用,維持了造血干細(xì)胞的生存。
我們所構(gòu)建的造血干細(xì)胞二維培養(yǎng)體系中,成骨細(xì)胞對于造血干/祖細(xì)胞培養(yǎng)的支持作用顯著優(yōu)于無成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系,其中骨髓MSC誘導(dǎo)成骨細(xì)胞對于造血干/祖細(xì)胞培養(yǎng)的支持作用顯著優(yōu)于其他各組培養(yǎng)體系,對于早期造血干細(xì)胞體外生存有更為明顯地支持作用,這說明該組培養(yǎng)體系更接近于體內(nèi)造血生態(tài)位區(qū)中成骨細(xì)胞的發(fā)生和二者間的比例構(gòu)成。此外,在MSC向成骨細(xì)胞逐漸分化過程中存在有不同分化階段的成骨前體細(xì)胞,它們對造血干/祖細(xì)胞體外培養(yǎng)可能具有不同的調(diào)節(jié)作用,這已經(jīng)在近的相關(guān)研究中得到了證實[13-15]。
本研究有別于其他有關(guān)成骨細(xì)胞對造血調(diào)控的研究方法,采用體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞,觀察其在無外源細(xì)胞因子的參與下對造血干細(xì)胞的支持作用,排除了體內(nèi)微環(huán)境其他細(xì)胞成分和因素對造血的影響,其結(jié)果進(jìn)一步證明了成骨細(xì)胞對造血調(diào)控的關(guān)鍵性作用和對造血干/祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的支持作用。本研究的結(jié)論對于臍血造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)提供了新的思路。
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