組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損的研究現(xiàn)狀及進展

作者：吳雪暉，羅飛，謝肇，許建中

作者單位：第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院骨科，全軍矯形外科中心，重慶400038

【摘要】  骨缺損的治療是困擾骨科臨床的難點，傳統(tǒng)的治療方法極為困難。隨著組織工程學(xué)的迅速發(fā)展，通過對種子細胞進行基因修飾、構(gòu)建復(fù)合支架材料及促進組織工程骨早期血管化等方法，使應(yīng)用組織工程技術(shù)治療骨缺損成為目前研究的熱點，作者對其研究現(xiàn)狀及進展進行了綜述。

【關(guān)鍵詞】  組織工程；骨缺損

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃資助重大攻關(guān)課題  （2006AA02A122）
　　Advances of repair of bone defect with tissue engineering technique
   
　　WU Xuehui,LUO Fei,XIE Zhao,et al.

    (Orthopedic Center of PLA,Department of Othopaedics,Southwest Hospital,Third Military Medical University, Chongqing400038,China)

    Abstract:The treatment for bone defect is difficult in orthopaedics clinic, and it is hard for traditional methods.With the rapid development of tissue engineering technique,repair of bone defect with tissue engineering has been the hotspot,such us gene modification of seed cells,construction of composite scaffold and promoting earlyperiod vascularization of tissue engineered bone etc.The author gives an overview to current situation and advances for its research.

    Key words:tissue engineering;bone defect

    骨缺損、特別是大段骨缺損常因創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨不連多次手術(shù)植骨內(nèi)固定失敗及先天性畸形所致，傳統(tǒng)的治療方法極為困難。終很多病例不得不采用截肢術(shù)或用支具保護性負重。近年來，隨著分子生物學(xué)研究的深入及組織工程學(xué)的迅速發(fā)展，使應(yīng)用生長因子和骨組織工程技術(shù)治療骨缺損成為目前研究的熱點［1］。其主要研究內(nèi)容包括種子細胞的選擇與培養(yǎng)、支架材料的選擇與修飾及組織工程化組織的構(gòu)建等［2］。本文就種子細胞、支架材料、生長因子的特點與作用及組織工程骨的血管化作一綜述。

    1種子細胞(seeding cells)

    理想的骨組織工程種子細胞應(yīng)該是具有成骨能力的細胞，其特點為：(1)細胞來源可靠，取材方便，對機體損傷??；(2)在體外培養(yǎng)體系中具有較強的增殖傳代能力，生物活性好，能夠在較短時間內(nèi)得到較多數(shù)量并易定向分化為成骨細胞；(3)植入機體后能適應(yīng)受區(qū)環(huán)境，保持高質(zhì)量成骨活性，且遠期效果良好；(4)生物毒性低，組織相容性好，免疫活性低，致瘤性低［3］。

    1.1骨與骨膜來源的成骨細胞(osteoblast)成骨細胞有良好的成骨能力，但取材困難、創(chuàng)傷大，來源有限，而且為成熟細胞，擴增能力有限，因此難以滿足大節(jié)段骨缺損對種子細胞的數(shù)量需求［4］。

    1.2胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES)屬于全能干細胞，具有無限增殖能力，從理論上可作為骨組織工程佳的種子細胞來源，但目前研究多停留在細胞建系上，對其誘導(dǎo)分化的研究還不夠深入，且由于倫理上的原因，從現(xiàn)階段來看，ES真正能夠用于骨組織工程還不太現(xiàn)實［5］。

    1.3成體干細胞(adult stem cells)在相當(dāng)長的一段時間內(nèi)，組織中的成體干細胞被認為僅能定向分化為特定的細胞系，即其所處組織的成熟細胞。近年來有學(xué)者已從皮膚、脂肪、肌肉等骨外組織中分離出能夠向成骨細胞分化的干細胞，但必須在誘導(dǎo)因子的作用下才能完成［6］，因而限制了其在骨組織工程中的應(yīng)用。

    1.4骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)BMSCs具有高度增殖、自我更新能力，可在不同誘導(dǎo)條件下分化為軟骨、骨、骨骼肌、肌腱、脂肪、真皮、神經(jīng)等，以骨髓中的含量為豐富。大量實驗表明，BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后再復(fù)合適當(dāng)?shù)闹Ъ懿牧希軌虍愇怀晒?、修?fù)骨缺損，是目前具有應(yīng)用前景的種子細胞［7］。但在骨髓中，BMSCs含量極少，作為種子細胞，必須達到一定的的密度才能保證其體內(nèi)成骨，因而必須對其進行分離和大量擴增才能滿足需要。

    1.5種子細胞的體外大規(guī)模擴增在體外短期內(nèi)獲得充足的種子細胞，是組織工程骨產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵性制約因素，目前所應(yīng)用的常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)無法滿足需要。研究人員已構(gòu)建了多種能提供微載體大規(guī)模擴增的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，如：模擬微重力旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器、固體轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器、攪動混合旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶、環(huán)繞混合培養(yǎng)皿和灌注培養(yǎng)系統(tǒng)等［8］。同時通過三維立體的培養(yǎng)方法，使細胞在材料孔隙的各個面上均能生長，更適合骨組織工程的要求。

    2支架材料(scaffold)

    目前，用于骨組織工程的細胞支架材料有兩大類，一類為人工合成細胞支架材料，另一類為天然細胞支架材料。

    2.1人工合成細胞支架材料分無機材料與有機高分子材料兩類，無機材料包括多孔羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)、生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic，BGC)等。它們雖有較好的生物相容性，但其塑形難、脆性大、降解時間長、表面活性較差，應(yīng)用受到了很大限制。自固化磷酸骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)可以注射入體內(nèi)并自行硬化，對所需填充部位做到充分填充，不留空隙，是近年來新出現(xiàn)的合成材料，為骨組織工程學(xué)者所關(guān)注［9］。有機高分子材料中聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid，PGA)及其共聚物(PLGA)應(yīng)用為廣泛。盡管它們有良好的生物相容性、可吸收性、材料的吸收率可以通過共聚單位的相關(guān)比例來控制等優(yōu)點，但仍存在著費用昂貴、降解率低、機械強度較差、可塑性不強及降解后產(chǎn)物會改變周圍環(huán)境pH值、導(dǎo)致纖維化甚至誘發(fā)免疫反應(yīng)等缺點。

    2.2天然細胞支架材料天然細胞支架材料有4種：（1）珊瑚：Petite等［10］以珊瑚為支架材料，用自體骨髓基質(zhì)干細胞為種子細胞，構(gòu)建了組織工程化跎骨，成功修復(fù)了羊跎骨25mm的骨缺損。（2）膠原：骨組織中主要為Ⅰ型膠原。它雖然因含特定的細胞識別信號而利于成骨細胞增殖分化，但由于缺乏一定的機械強度，難以單獨用作成骨細胞培養(yǎng)基質(zhì)材料。（3）甲殼素：甲殼素是一種天然高分子多糖，由于其本身安全無毒、可降解、生物相容性好，作為組織工程中細胞培養(yǎng)的支架材料有著廣闊的前景。（4）脫鈣骨基質(zhì)(decalcified bone matrix，DBM)：同種異體DBM具有極低的免疫原性、良好的細胞及組織相容性及消毒后保持其骨誘導(dǎo)能力的特性，本身亦具有一定力學(xué)強度，通過改變脫鈣率可以調(diào)節(jié)其力學(xué)強度，以適應(yīng)臨床不同植骨部位的需要［11，12］。通過采集前病原學(xué)檢測和相應(yīng)的加工處理，可以保證其具有較好的生物安全性。

    2.3復(fù)合支架材料為克服以上支架單獨使用的不足，許多學(xué)者將幾種材料按一定比例復(fù)合后用于骨修復(fù)，如HA與TCP、HA與膠原、HA與PLGA復(fù)合等，復(fù)合材料不但能保證足夠的強度而且能有效地結(jié)合種子細胞和生長因子，有利于組織工程骨的構(gòu)建［13］。另外，利用納米技術(shù)制備有機/無機復(fù)合材料，并將生長因子、基因等特定分子識別信號固定在材料表面，對其進行分子設(shè)計和生物化處理，研制成新一代有特定結(jié)構(gòu)和功能的仿生“智能”基質(zhì)材料是當(dāng)今組織工程學(xué)和生物材料學(xué)研究領(lǐng)域的前沿課題［14］。

    3生長因子(growth factor)

    生長因子可對細胞分裂、基質(zhì)合成和組織分化等重要功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。在骨創(chuàng)傷早期，生長因子主要通過自分泌和旁分泌作用刺激成骨細胞前體分化增殖，激活成骨細胞活性，促進成骨。后期作用逐漸減弱，但也參與骨的生長調(diào)節(jié)。

    3.1骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)目前已測出16種BMP的序列，其中重組人的BMP-2、BMP-8均具有高效的骨誘導(dǎo)能力，能夠促進未分化的間充質(zhì)細胞和成骨細胞的前體細胞分化為成骨細胞，引導(dǎo)成骨細胞表型的表達，增加骨膠原的合成，在骨形成中起著重要作用，因而成為研究和應(yīng)用為廣泛的生長因子［15］。

    3.2胰島素樣生長因子(insulinlike growth factor，ILGF)ILGF是一類結(jié)構(gòu)上類似于胰島素原的多肽，它能促進成骨細胞的增殖和基質(zhì)合成，具有刺激骨缺損修復(fù)的作用。

    3.3成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)FGF由成骨細胞產(chǎn)生，能刺激成骨細胞內(nèi)的DNA合成，使成骨細胞內(nèi)骨鈣素增加，加速骨的鈣化，使新骨形成。

    3.4血小板衍生生長因子(plateletderived growth factor，PDGF)PDGF既可刺激軟骨細胞和成骨細胞的增殖、分化，又可調(diào)節(jié)破骨細胞的骨吸收，并可間接地誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞增殖與血管發(fā)生。PDGF還可促進創(chuàng)傷局部組織的連接，增加膠原合成和增加局部應(yīng)力。

    3.5血管內(nèi)皮生長因子(ascular endothelial growth factoer，VEGF)VEGF作為一種特異性促血管內(nèi)皮細胞增生及血管生成因子，對正常生理及病理過程中的血管再生起著關(guān)鍵性作用。

    3.6β轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factorβ，TGFβ)TGFβ在成骨細胞中合成并作用于成骨細胞，調(diào)節(jié)其增殖和分化，促進成骨和成軟骨細胞增生，刺激Ⅰ型膠原合成，誘導(dǎo)膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨過程。

    4組織工程骨(tissue engineering bone，TEB)的血管化
   
　　研究證明，用組織工程骨修復(fù)骨缺損時，其早期成骨及后期骨愈合效果明顯。但應(yīng)用大塊組織工程骨修復(fù)大段骨缺損時，其核心部位往往發(fā)生缺血壞死，主要原因就在于未能很好解決組織工程骨的早期血管化問題［16］。

    目前的主要方法有：

    4.1血管內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)與成骨細胞(osteoblast)或血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)加生物材料聯(lián)合移植。此方法需要大量培養(yǎng)、擴增血管內(nèi)皮細胞。細胞體外培養(yǎng)的要求很高，周期長，規(guī)模擴增相當(dāng)困難。且成熟血管內(nèi)皮細胞的成血管作用較弱［17］。

    4.2應(yīng)用顯微外科技術(shù)將成骨細胞、生物材料及帶血管蒂的組織瓣包埋或血管束植入重建組織工程骨血運。此方法能夠得到血管化的組織工程骨，但必須將其異位植入，待血管束長入后再斷蒂用于移植，不但有異位創(chuàng)傷的問題，而且等待的時間也較長［18］。

    4.3利用VEGF、血管生成素(angiopoletin，Ang)等與生物材料復(fù)合促進血管生長。促血管生長因子直接應(yīng)用在體內(nèi)會迅速降解為無活性的片段，達不到理想的效應(yīng)濃度；而采用大劑量給藥又易導(dǎo)致局部血管瘤。因此有學(xué)者［19］將各種促血管生長因子的基因通過轉(zhuǎn)染技術(shù)，使其在種子細胞內(nèi)表達，再將這種轉(zhuǎn)染細胞種植于支架材料表面構(gòu)建組織工程骨后植于骨缺損部位，這是組織工程骨血管化的主要研究方向之一。存在的主要問題是如何提高轉(zhuǎn)染率，使細胞高效表達，以及細胞的安全性和免疫問題。

    4.4利用血管內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在血管新生中的促血管生成作用促進組織工程骨的血管化。Asahara等［20］于1997年報道在成人外周血中分離出EPCs。它是一群能增殖并分化為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，不僅參與人胚胎血管生成，而且在出生后的血管新生過程中有很強的促血管生成作用，并能以血管發(fā)生方式形成新生血管。這一發(fā)現(xiàn)，更新了傳統(tǒng)意義上的出生后血管生成、血管損傷修復(fù)的理論，為缺血性疾病的治療提供了新的思路。有研究將EPCs與BMSCs及DBM共同構(gòu)建促血管化組織工程骨，修復(fù)兔橈骨大段骨缺損取得良好效果［21］。Niagara采用VEGF和Ang-1雙重基因轉(zhuǎn)染的自體EPCs與MSCs混合培養(yǎng)，使EPCs能迅速轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細胞，分泌促血管生長因子，并促使MSCs向內(nèi)皮細胞分化，從而促進組織工程骨的早期血管化［22］。

    5小結(jié)

    現(xiàn)階段利用組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損的主要方向是：(1)選擇合適的種子細胞并對其進行基因修飾。(2)構(gòu)建復(fù)合支架材料，使其既具有良好的表面活性和三維立體結(jié)構(gòu)，能特異性調(diào)控種子細胞的黏附、增殖、定向分化，又能有效控制特定生長因子的釋放。(3)利用顯微外科技術(shù)、EPCs、促血管生長因子及基因技術(shù)促進組織工程骨的早期血管化。

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